Development of a high throughput continuous fluorescence anisotropy-based assay to analyse peptidoglycan-digesting enzymes
تقدم هذه الورقة مقايسة استمرارية لتباين الخواص الفلورية، تتسم بالمتانة والإنتاجية العالية، باستخدام ببتيدوجليكان موسوم فلورياً بشكل طبيعي للتغلب على التحديات التقنية في دراسة إنزيمات الجدار الخلوي البكتيري وتسريع اكتشاف مركبات جديدة مضادة للميكروبات.
البحث الأصلي مرخَّص بموجب CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). هذا شرح مولَّده بالذكاء الاصطناعي لبحث مسبق لم يخضع لمراجعة الأقران. وهو ليس نصيحة طبية. لا تتخذ أي قرارات تتعلق بصحتك بناءً على هذا المحتوى. اقرأ إخلاء المسؤولية الكامل
تُعد البكتيريا كائنات مجهرية ناجية، لكنها تعيش في حالة مستمرة من الضغط العالي. فداخل أجسامها الضئيلة، يدفع السائل نحو الخارج بقوة كافية لتفجيرها مثل بالون مفرط الامتلاء. وللبقاء على قيد الحياة، تبني هذه الكائنات غلافاً صلباً يشبه الشبكة حول نفسها، وهو هيكل مكون من سلاسل سكرية وروابط ببتيدية يعمل كالهيكل العظمي وبدلة ضغط في آن واحد. هذا الغلاف، المعروف باسم "الببتيدوجليكان"، ليس جداراً ثابتاً؛ بل يجب إصلاحه وتشكيله وتوسيعه باستمرار مع نمو البكتيريا وانقسامها. وتعمل إنزيمات متخصصة بمثابة طاقم بناء، حيث تقوم بقطع ولصق المواد للحفاظ على التوازن المثالي بين القوة والمرونة. وإذا تعطلت هذه الإنزيمات، يفشل الجدار الخلوي وتموت البكتيريا. ولأن هذه العملية حيوية للغاية، فقد نظر العلماء منذ زمن طويل إلى هذه الإنزيمات كأهداف لمضادات حيوية جديدة، آملين في إيقاف طاقم البناء وترك الضغط ينتصر. ومع ذلك، كانت دراسة هذه الإنزيمات صعبة للغاية؛ فالغلاف الذي تعمل عليه هو بوليمر معقد وغير قابل للذوبان يقاوم الاختبارات المختبرية القياسية، مما يضطر الباحثين إلى الاعتماد على طرق بطيئة ومجهدة تجعل من الصعب فحص الأدوية الجديدة بسرعة.
لقد طور فريق من الباحثين في جامعة وارويك طريقة جديدة لمراقبة هذه الإنزيمات أثناء عملها، محولين عملية بطيئة وضبابية إلى قياس سريع وواضح. فبدلاً من محاولة رؤية الأجزاء الصغيرة من الغلاف وهي تتفكك تحت المجهر أو فصلها باستخدام آلات معقدة، قرر الفريق جعل الغلاف نفسه يتوهج. قاموا بتنمية البكتيريا في حمام مغذٍ يحتوي على نسخة فلورية خاصة من وحدة بناء تسمى "D-alanine". وبينما كانت البكتيريا تبني جدرانها، قامت دون علم منها بدمج هذه الكتل المتوهجة في الشبكة. بعد ذلك، قام الباحثون بحصاد هذه القشور المتوهجة، وتنظيفها، واستخدامها كركيزة لتجاربهم. وعندما أضافوا الإنزيمات التي تهضم الجدار عادةً، تكسرت القطع المتوهجة إلى أجزاء أصغر. وفي عالم فيزياء الضوء، تدور الجزيئات الكبيرة ببطء في السائل، بينما تدور الجزيئات الصغيرة بسرعة. ومن خلال تسليط ضوء مستقطب على الخليط وقياس كيفية ارتداد الضوء، استطاع الفريق معرفة ما إذا كان الغلاف المتوهج لا يزال هيكلاً كبيراً بطيئ الدوران أم أنه قد تقطع إلى قطع صغيرة سريعة الدوران بشكل فوري. وقد وفر هذا التغيير في إشارة الضوء قراءة مباشرة وفورية لنشاط الإنزيم.
اختبر الباحثون هذه الطريقة على "الببتيدوجليكان" من أربعة أنواع مختلفة تماماً من البكتيريا: بكتيريا معوية شائعة، ونوعين من بكتيريا المكورات العنقودية والمكورات العقدية، وبكتيريا صلبة شمعية تسبب عدوى خطيرة. ووجدوا أن القشور المتوهجة عملت بشكل مثالي كركيزة لمجموعة متنوعة من الإنزيمات. فعندما أضافوا إنزيماً معروفاً بقدرته على قطع السلاسل السكرية، انخفضت إشارة الضوء فوراً، مما يشير إلى تفكك الجدار. وعندما أضافوا إنزيماً يعمل فقط على نوع معين من الجدران البكتيرية، تغيرت الإشارة فقط لهذا الجدار المحدد، مما أثبت قدرة الطريقة على التمييز بين الأهداف البيولوجية المختلفة. كما كان النظام سريعاً بما يكفي لإجراء عشرات الاختبارات في طبق واحد، حيث أكمل تحليلاً يستغرق ساعات بالطرق التقليدية في غضون دقائق. وأظهر الفريق أيضاً أن الطريقة يمكنها اكتشاف المثبطات، وهي المواد التي توقف عمل الإنزيمات. فعندما أضافوا مادة كيميائية معروفة بقدرتها على حظر إنزيم معين، ظل الغلاف المتوهج سليماً، وظلت إشارة الضوء ثابتة، مما أكد تعطيل الإنزيم بنجاح.
يقدم هذا النهج ميزة كبيرة مقارنة بالطرق القديمة لقياس نشاط الإنزيمات، والتي كانت تعتمد غالباً على قياس مدى عتامة المحلول مع ذوبان الجدار. كانت تلك الطريقة القديمة بطيئة وغالباً ما تعطي نتائج غير دقيقة، مما يجعل من الصعب رصد الاختلافات الدقيقة أو اختبار أعداد كبيرة من المرشحات الدوائية المحتملة بسرعة. وتتميز طريقة الفلورة الجديدة بالدقة والحساسية، وهي قادرة على اكتشاف حتى التغييرات الصغيرة في حجم الجزيئات. وحسب الباحثون درجة إحصائية لتوضيذا مدى موثوقية الاختبار لعمليات الفحص عالية الإنتاجية، وهو معيار مستخدم في اكتشاف الأدوية لتصفية آلاف المركبات بسرعة. وكانت الدرجة التي حققوها أعلى بكثير من العتبة المطلوبة لمثل هذه الاختبارات واسعة النطاق، مما يشير إلى أن الطريقة قوية بما يكفي للاستخدام الصناعي. كما لاحظوا أنه بينما تعد الطريقة ممتازة لقياس سرعة عمل الإنزيم أو مدى قدرة الدواء على إيقافه، إلا أنها لا تستطيع إخبارهم بالهيكل الكيميائي الدقيق للقطع المتكسرة، وهي مهمة لا تزال تتطلب معدات أكثر تعقيداً.
يمثل هذا العمل تحولاً عملياً في كيفية دراسة الجدار الخلوي البكتيري. فمن خلال تغيير كيفية تغذية البكتيريا أثناء النمو ببساطة، ابتكر الفريق أداة تحول مشكلة بيولوجية معقدة إلى قياس ضوئي بسيط. وهذا يسمح للباحثين باختبار العديد من تركيبات الإنزيمات والجدران البكتيرية في وقت واحد، مما يسرع عملية فهم كيفية عمل طواقم البناء المجهرية هذه. ورغم أن الطريقة لا تحل كل المشكلات في هذا المجال، إلا أنها توفر وسيلة واضحة وفعالة ومنخفضة التكلفة لفحص طرق جديدة لتعطيل النمو البكتيري. وبالنسبة للعلماء الذين يبحثون عن الجيل القادم من المضادات الحيوية، فإن امتلاك أداة يمكنها قياس نشاط هذه الإنزيمات الأساسية بسرعة ودقة يمكن أن يسرع من اكتشاف الأدوية المنقذة للحياة.
غارق في أبحاث مجالك؟
تصلك نشرة يومية بأحدث الأبحاث المطابقة لكلماتك البحثية المفتاحية — مع ملخصات تقنية، بلغتك.