Development of a high throughput continuous fluorescence anisotropy-based assay to analyse peptidoglycan-digesting enzymes
Diese Arbeit präsentiert einen robusten, hochdurchsatzfähigen kontinuierlichen Fluoreszenzanisotropie-Assay unter Verwendung von nativ fluoreszierend markiertem Peptidoglycan, um technische Herausforderungen bei der Untersuchung bakterieller Zellwandenzyme zu überwinden und die Entdeckung neuartiger antimikrobieller Verbindungen zu beschleunigen.
Originalarbeit lizenziert unter CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dies ist eine KI-generierte Erklärung eines Preprints, das nicht peer-reviewed wurde. Dies ist kein medizinischer Rat. Treffen Sie keine Gesundheitsentscheidungen auf Grundlage dieses Inhalts. Vollständigen Haftungsausschluss lesen
Bakterien sind mikroskopisch kleine Überlebenskünstler, aber sie leben in einem Zustand ständigen hohen Drucks. In ihren winzigen Körpern drückt die Flüssigkeit mit einer solchen Kraft nach außen, dass sie sie wie einen überfüllten Ballon zum Platzen bringen könnte. Um zu überleben, bauen sie eine zähe, netzartige Hülle um sich herum auf – eine Struktur aus Zuckerketten und Peptidverbindungen, die sowohl als Skelett als auch als Druckanzug dient. Diese Hülle, bekannt als Peptidoglykan, ist keine statische Wand; sie muss ständig repariert, umgestaltet und erweitert werden, während das Bakterium wächst und sich teilt. Spezialisierte Enzyme fungieren dabei als Bauteams, die das Material zuschneiden und zusammenfügen, um das perfekte Gleichgewicht zwischen Stärke und Flexibilität zu halten. Wenn diese Enzyme Fehlfunktionen aufweisen, versagt die Zellwand und das Bakterium stirbt. Da dieser Prozess so lebenswichtig ist, haben Wissenschaftler diese Enzyme seit langem als Angriffsziele für neue Antibiotika ins Auge gefasst, in der Hoffnung, das Bauteam zu stoppen und den Druck gewinnen zu lassen. Die Untersuchung dieser Enzyme hat sich jedoch als äußerst schwierig erwiesen. Die Hülle, an der sie arbeiten, ist ein komplexes, unlösliches Polymer, das herkömmliche Labortests widersteht, was Forscher dazu zwingt, sich auf langsame, arbeitsintensive Methoden zu verlassen, die es schwierig machen, schnell nach neuen Medikamenten zu suchen.
Ein Forschungsteam der University of Warwick hat eine neue Möglichkeit entwickelt, diese Enzyme bei der Arbeit zu beobachten, indem es einen langsamen, unscharfen Prozess in eine schnelle, klare Messung verwandelt. Anstatt zu versuchen, die winzigen Teile der Hülle unter einem Mikroskop auseinanderbrechen zu zu sehen oder sie mit komplexen Maschinen zu trennen, entschied sich das Team dafür, die Hülle selbst leuchten zu lassen. Sie züchteten Bakterien in einem Nährstoffbad, das eine spezielle, fluoreszierende Version eines Bausteins namens D-Alanin enthielt. Während die Bakterien ihre Wände bauten, bauten sie diese leuchtenden Blöcke unwissentlich in das Netz ein. Die Forscher ernteten dann diese leuchtenden Hüllen, reinigten sie auf und nutzten sie als Substrat für ihre Experimente. Wenn sie die Enzyme hinzufügten, die normalerweise die Wand verdauen, zerfielen die leuchtenden Teile in kleinere Fragmente. In der Welt der Lichtphysik rotieren große Moleküle in einer Flüssigkeit langsam, während kleine Moleküle schnell rotieren. Durch das Bestrahlen der Mischung mit polarisiertem Licht und das Messen, wie das Licht zurückgeworfen wird, konnte das Team sofort erkennen, ob die leuchtende Hülle noch eine große, langsam rotierende Struktur war oder ob sie in schnell rotierende Teile zerlegt worden war. Diese Änderung des Lichtsignals lieferte ein direktes Echtzeit-Ableseverfahren der Enzymaktivität.
Die Forscher testeten diese Methode an Peptidoglykan von vier sehr unterschiedlichen Arten von Bakterien: einem häufigen Darmbakterium, zwei Arten von Staphylokokken und Streptokokken sowie einem zähen, wachsartigen Bakterium, das schwere Infektionen verursacht. Sie fanden heraus, dass die leuchtenden Hüllen perfekt als Substrat für eine Vielzahl von Enzymen funktionierten. Als sie ein Enzym hinzufügten, das für das Zerschneiden der Zuckerketten bekannt ist, sank das Lichtsignal sofort, was darauf hindeutete, dass die Wand abgebaut wurde. Als sie ein Enzym hinzufügten, das nur an einer spezifischen Art von bakterieller Wand arbeitet, änderte sich das Signal nur für diese spezifische Wand, was bewies, dass die Methode zwischen verschiedenen biologischen Zielen unterscheiden konnte. Das System war schnell genug, um Dutzende von Tests in einer einzigen Platte durchzuführen, wodurch eine Analyse in Minuten abgeschlossen wurde, die mit traditionellen Techniken Stunden gedauert hätte. Das Team demonstrierte auch, dass die Methode Inhibitoren nachweisen kann – Substanzen, die die Enzyme daran hindern zu arbeiten. Als sie eine Chemikalie hinzufügten, die bekannt dafür ist, ein spezifisches Enzym zu blockieren, blieb die leuchtende Hülle intakt und das Lichtsignal blieb stabil, was bestätigte, dass das Enzym erfolgreich deaktiviert worden war.
Dieser Ansatz bietet einen signifikanten Vorteil gegenüber den alten Methoden zur Messung der Enzymaktivität, die oft darauf basierten, wie trüb eine Lösung wurde, während sich die Wand auflöste. Diese alte Methode war langsam und lieferte oft unscharfe Ergebnisse, was es schwierig machte, subtile Unterschiede zu erkennen oder eine große Anzahl potenzieller Wirkstoffkandidaten schnell zu testen. Die neue Fluoreszenzmethode ist präzise und empfindlich und in der Lage, selbst kleinste Änderungen in der Größe der Moleküle zu detektieren. Die Forscher berechneten einen statistischen Score, um zu zeigen, wie zuverlässig der Test für das High-Throughput-Screening ist – ein Standard in der Arzneimittelentwicklung, um tausende Verbindungen schnell zu filtern. Den Score, den sie erreichten, lag deutlich über dem Schwellenwert, der für solche groß angelegten Tests als notwendig gilt, was darauf hindeutet, dass die Methode robust genug für den industriellen Einsatz ist. Sie merkten auch an, dass die Methode zwar exzellent darin ist, zu messen, wie schnell ein Enzym arbeitet oder wie gut ein Medikament es stoppt, sie aber nicht die genaue chemische Struktur der Bruchstücke bestimmen kann – eine Aufgabe, die weiterhin komplexere Ausrüstungen erfordert.
Die Arbeit stellt eine praktische Verschiebung in der Art und Weise dar, wie Wissenschaftler die bakterielle Zellwand untersuchen können. Indem sie einfach die Art und Weise änderten, wie die Bakterien während des Wachstums ernährt werden, schuf das Team ein Werkzeug, das ein komplexes biologisches Problem in eine einfache Lichtmessung verwandelt. Dies ermöglicht es Forschern, viele verschiedene Kombinationen von Enzymen und bakteriellen Wänden gleichzeitig zu testen, was den Prozess beschleunigt, die Funktionsweise dieser mikroskopisch kleinen Bauteams zu verstehen. Obwohl die Methode nicht jedes Problem auf diesem Gebiet löst, bietet sie einen klaren, effizienten und kostengünstigen Weg, um nach neuen Möglichkeiten zu suchen, das bakterielle Wachstum zu stören. Für Wissenschaftler, die nach der nächsten Generation von Antibiotika suchen, könnte ein Werkzeug, das die Aktivität dieser essenziellen Enzyme schnell und genau messen kann, die Entdeckung lebensrettender Medikamente beschleunigen.
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