Development of a high throughput continuous fluorescence anisotropy-based assay to analyse peptidoglycan-digesting enzymes
Questo articolo presenta un saggio di anisotropia di fluorescenza continua, robusto e ad alto rendimento, che utilizza peptidoglicano marcato nativamente con fluorescenza per superare le sfide tecniche nello studio degli enzimi della parete cellulare batterica e accelerare la scoperta di nuovi composti antimicrobici.
Articolo originale sotto licenza CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Questa è una spiegazione generata dall'IA di un preprint non sottoposto a revisione paritaria. Non è un consiglio medico. Non prendere decisioni sulla salute basandoti su questo contenuto. Leggi il disclaimer completo
I batteri sono sopravvissuti microscopici, ma vivono in uno stato costante di alta pressione. All'interno dei loro minuscoli corpi, il fluido spinge verso l'esterno con una forza sufficiente a farli scoppiare come un palloncino troppo gonfio. Per sopravvivere, costruiscono un guscio resistente e simile a una rete attorno a se stessi, una struttura fatta di catene di zuccheri e legami peptidici che funge sia da scheletro che da tuta antiusura. Questo guscio, noto come peptidoglicano, non è una parete statica; deve essere costantemente riparato, rimodellato ed espanso man mano che il batterio cresce e si divide. Enzimi specializzati agiscono come la squadra di costruzione, tagliando e incollando il materiale per mantenere il perfetto equilibrio tra forza e flessibilità. Se questi enzimi funzionano male, la parete cellulare cede e il batterio muore. Poiché questo processo è così vitale, gli scienziati guardano da tempo a questi enzimi come bersagli per nuovi antibiotici, sperando di fermare la squadra di costruzione e lasciare che la pressione vinca. Tuttavia, studiare questi enzimi è stato notoriamente difficile. Il guscio su cui lavorano è un polimero complesso e insolubile che resiste ai test standard di laboratorio, costringendo i ricercatori a fare affidamento su metodi lenti e laboriosi che rendono difficile lo screening di nuovi farmaci rapidamente.
Un team di ricercatori dell'Università di Warwick ha sviluppato un nuovo modo per osservare questi enzimi al lavoro, trasformando un processo lento e sfocato in una misurazione veloce e chiara. Invece di cercare di vedere i minuscoli pezzi del guscio che si rompono sotto un microscopio o separarli con macchine complesse, il team ha deciso di far brillare il guscio stesso. Hanno fatto crescere batteri in un bagno nutritivo contenente una versione speciale e fluorescente di un elemento costruttivo chiamato D-alanina. Mentre i batteri costruivano le loro pareti, incorporavano inconsapevolmente questi blocchi luminosi nella rete. I ricercatori hanno poi raccolto questi gusci luminosi, li hanno puliti e li hanno usati come substrato per i loro esperimenti. Quando hanno aggiunto gli enzimi che normalmente digeriscono la parete, i pezzi luminosi si sono frammentati in pezzi più piccoli. Nel mondo della fisica della luce, le grandi molecole ruotano lentamente in un liquido, mentre le piccole molecole ruotano velocemente. Facendo risplendere una luce polarizzata sulla miscela e misurando come la luce rimbalzava, il team poteva capire istantaneamente se il guscio luminoso era ancora una struttura grande e a rotazione lenta o se era stato trinciato in pezzi piccoli e a rotazione veloce. Questo cambiamento nel segnale luminoso forniva una lettura diretta e in tempo reale dell'attività dell'enzima.
I ricercatori hanno testato questo metodo sul peptidoglicano di quattro tipi molto diversi di batteri: un comune batterio intestinale, due tipi di batteri stafilococchi e streptococchi, e un batterio coriaceo e ceroso che causa gravi infezioni. Hanno scoperto che i gusci luminosi funzionavano perfettamente come substrato per una varietà di enzimi. Quando hanno aggiunto un enzima noto per tagliare le catene di zucchero, il segnale luminoso è sceso immediatamente, indicando che la parete si stava rompendo. Quando hanno aggiunto un enzima che lavora solo su un tipo specifico di parete batterica, il segnale è cambiato solo per quella specifica parete, provando che il metodo poteva distinguere tra diversi bersagli biologici. Il sistema era abbastanza veloce da eseguire decine di test in una singola piastra, completando un'analisi in minuti che avrebbero richiesto ore con le tecniche tradizionali. Il team ha anche dimostrato che il metodo poteva rilevare gli inibitori, sostanze che fermano l'azione degli enzimi. Quando hanno aggiunto una sostanza chimica nota per bloccare un enzima specifico, il guscio luminoso è rimasto intatto e il segnale luminoso è rimasto costante, confermando che l'enzima era stato disattivato con successo.
Questo approccio offre un vantaggio significativo rispetto ai vecchi modi di misurare l'attività enzimatica, che spesso si basavano sulla misurazione di quanto una soluzione diventasse torbida mentre la parete si dissolveva. Quel vecchio metodo era lento e spesso dava risultati sfocati, rendendo difficile individuare differenze sottili o testare rapidamente un gran numero di potenziali candidati farmaci. Il nuovo metodo a fluorescenza è preciso e sensibile, capace di rilevare anche piccoli cambiamenti nelle dimensioni delle molecole. I ricercatori hanno calcolato un punteggio statistico per mostrare quanto sia affidabile il test per lo screening ad alto rendimento, uno standard nella scoperta di farmaci utilizzato per filtrare rapidamente migliaia di composti. Il punteggio che hanno ottenuto era ben al di sopra della soglia considerata necessaria per tali test su larga scala, suggerendo che il metodo sia robusto abbastanza per l'uso industriale. Hanno anche notato che, sebbene il metodo sia eccellente per misurare quanto velocemente un enzima lavora o quanto bene un farmaco lo blocca, non può dire loro la struttura chimica esatta dei pezzi rotti, un compito che richiede ancora apparecchiature più complesse.
Il lavoro rappresenta un cambiamento pratico nel modo in cui gli scienziati possono studiare la parete cellulare batterica. Semplicemente cambiando il modo in cui i batteri vengono nutriti durante la crescita, il team ha creato uno strumento che trasforma un problema biologico complesso in una semplice misurazione della luce. Ciò consente ai ricercatori di testare molte combinazioni diverse di enzimi e pareti batteriche contemporaneamente, accelerando il processo di comprensione di come operano queste squadre di costruzione microscopiche. Sebbene il metodo non risolva ogni problema nel campo, fornisce un modo chiaro, efficiente ed economico per cercare nuovi modi per interrompere la crescita batterica. Per gli scienziati alla ricerca della prossima generazione di antibiotici, avere uno strumento in grado di misurare rapidamente e accuratamente l'attività di questi enzimi essenziali potrebbe accelerare la scoperta di farmaci salvavita.
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