Development of a high throughput continuous fluorescence anisotropy-based assay to analyse peptidoglycan-digesting enzymes
यह शोध पत्र बैक्टीरिया की कोशिका भित्ति के एंजाइमों के अध्ययन में तकनीकी चुनौतियों को दूर करने और नवीन रोगाणुरोधी यौगिकों की खोज को गति देने के लिए स्वाभाविक रूप से फ्लोरोसेंट रूप से लेबल किए गए पेप्टिडोग्लाइकन का उपयोग करते हुए एक सुदृढ़, उच्च-थ्रूपुट निरंतर फ्लोरोसेंस एनिसोट्रॉपी परख प्रस्तुत करता है।
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बैक्टीरिया सूक्ष्म उत्तरजीवी हैं, लेकिन वे निरंतर उच्च दबाव की स्थिति में रहते हैं। अपने नन्हे शरीरों के भीतर, तरल पदार्थ इतनी ताकत के साथ बाहर की ओर धकेलता है कि वे एक अत्यधिक भरे हुए गुब्बारे की तरह फट सकते हैं। जीवित रहने के लिए, वे अपने चारों ओर एक मजबूत, जालीदार कवच बनाते हैं, जो शर्करा श्रृंखलाओं (sugar chains) और पेप्टाइड कड़ियों से बना एक ढांचा है जो कंकाल और प्रेशर सूट दोनों के रूप में कार्य करता है। यह कवच, जिसे पेप्टिडोग्लाइकन (peptidoglycan) कहा जाता है, कोई स्थिर दीवार नहीं है; इसे बैक्टीरिया के बढ़ते और विभाजित होने के दौरान लगातार मरम्मत, नया आकार देने और विस्तार करने की आवश्यकता होती है। विशेष एंजाइम निर्माण दल (construction crew) के रूप में कार्य करते हैं, जो मजबूती और लचीलेपन के बीच सही संतुलन बनाए रखने के लिए सामग्री को काटने और जोड़ने का काम करते हैं। यदि ये एंजाइम खराब हो जाते हैं, तो कोशिका भित्ति विफल हो जाती है, और बैक्टीरिया मर जाता है। चूंकि यह प्रक्रिया इतनी महत्वपूर्ण है, इसलिए वैज्ञानिकों ने लंबे समय से इन एंजाइमों को नए एंटीबायोटिक्स के लक्ष्यों के रूप में देखा है, इस उम्मीद में कि वे निर्माण दल को रोक सकें और दबाव को जीतने दें। हालांकि, इन एंजाइमों का अध्ययन करना बेहद कठिन रहा है। जिस कवच पर वे काम करते हैं, वह एक जटिल, अघुलनशील पॉलीमर है जो मानक प्रयोगशाला परीक्षणों का विरोध करता है, जिससे शोधकर्ताओं को धीमी, श्रमसाध्य विधियों पर निर्भर रहना पड़ता है जो नए ड्रग्स की तेजी से स्क्रीनिंग करना कठिन बना देती हैं।
वारविक विश्वविद्यालय के शोधकर्ताओं ने इन एंजाइमों को काम करते हुए देखने का एक नया तरीका विकसित किया है, जिसने एक धीमी, धुंधली प्रक्रिया को एक तेज़, स्पष्ट माप में बदल दिया है। सूक्ष्मदर्शी के नीचे कवच के छोटे टुकड़ों को टूटते हुए देखने या उन्हें जटिल मशीनों से अलग करने के बजाय, टीम ने स्वयं कवच को चमकने (glow) का निर्णय लिया। उन्होंने डी-एलेनिन (D-alanine) नामक एक बिल्डिंग ब्लॉक के विशेष, फ्लोरोसेंट संस्करण वाले पोषक तत्व के घोल में बैक्टीरिया को उगाया। जैसे ही बैक्टीरिया ने अपनी दीवारें बनाईं, उन्होंने अनजाने में इन चमकने वाले ब्लॉकों को जाली में शामिल कर लिया। शोधकर्ताओं ने फिर इन चमकते हुए कवचों को निकाला, उन्हें साफ किया, और उन्हें अपने प्रयोगों के लिए एक सबस्ट्रेट (substrate) के रूप में उपयोग किया। जब उन्होंने उन एंजाइमों को मिलाया जो सामान्यतः दीवार को पचाते हैं, तो चमकते हुए टुकड़े छोटे टुकड़ों में टूट गए। प्रकाश भौतिकी (light physics) की दुनिया में, बड़े अणु तरल में धीरे घूमते हैं, जबकि छोटे अणु तेजी से घूमते हैं। मिश्रण पर ध्रुवीकृत प्रकाश (polarized light) डालकर और यह मापकर कि प्रकाश वापस कैसे उछल रहा है, टीम तुरंत बता सकती थी कि चमकता हुआ कवच अभी भी एक बड़ा, धीरे घूमने वाला ढांचा है या उसे तेज गति से घूमने वाले टुकड़ों में काट दिया गया है। प्रकाश के संकेत में इस बदलाव ने एंजाइम की गतिविधि का सीधा, वास्तविक समय का डेटा प्रदान किया।
शोधकर्ताओं ने चार बहुत अलग प्रकार के बैक्टीरिया के पेप्टिडोग्लाइकन पर इस विधि का परीक्षण किया: एक सामान्य आंत का बैक्टीरिया, स्टैफ और स्ट्रेप के दो प्रकार के बैक्टीरिया, और एक सख्त, मोमी बैक्टीरिया जो गंभीर संक्रमण का कारण बनता है। उन्होंने पाया कि चमकते हुए कवच विभिन्न प्रकार के एंजाइमों के लिए एक आदर्श सबस्ट्रेट के रूप में काम करते हैं। जब उन्होंने शर्करा श्रृंखलाओं को काटने वाले एक एंजाइम को मिलाया, तो प्रकाश का संकेत तुरंत गिर गया, जो दर्शाता था कि दीवार टूट रही है। जब उन्होंने एक ऐसे एंजाइम को मिलाया जो केवल एक विशिष्ट प्रकार की बैक्टीरिया दीवार पर काम करता है, तो संकेत केवल उस विशिष्ट दीवार के लिए बदला, जिससे सिद्ध हुआ कि यह विधि विभिन्न जैविक लक्ष्यों के बीच अंतर कर सकती है। यह प्रणाली इतनी तेज़ थी कि एक ही प्लेट में दर्जनों परीक्षण किए जा सकते थे, जिससे एक ऐसा विश्लेषण मिनटों में पूरा हो गया जिसमें पारंपरिक तकनीकों के साथ घंटों लग जाते। टीम ने यह भी प्रदर्शित किया कि यह विधि अवरोधकों (inhibitors) का पता लगा सकती है, जो एंजाइमों के काम करने को रोकते हैं। जब उन्होंने एक रसायन मिलाया जो एक विशिष्ट एंजाइम को ब्लॉक करता है, तो चमकता हुआ कवच बरकरार रहा, और प्रकाश का संकेत स्थिर रहा, जिससे पुष्टि हुई कि एंजाइम को सफलतापूर्वक अक्षम कर दिया गया था।
यह दृष्टिकोण एंजाइम गतिविधि को मापने के पुराने तरीकों की तुलना में एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है, जो अक्सर दीवार के घुलने पर घोल के धुंधला होने (cloudiness) को मापने पर निर्भर करते थे। वह पुरानी विधि धीमी थी और अक्सर धुंधले परिणाम देती थी, जिससे सूक्ष्म अंतरों को पहचानना या बड़ी संख्या में संभावित ड्रग उम्मीदवारों का परीक्षण करना कठिन हो जाता था। नई फ्लोरोसेंट विधि सटीक और संवेदनशील है, जो अणुओं के आकार में छोटे परिवर्तनों का पता लगाने में सक्षम है। शोधकर्ताओं ने एक सांख्यिकीय स्कोर की गणना की ताकि यह दिखाया जा सके कि यह परीक्षण हाई-थ्रूपुट स्क्रीनिंग (high-throughput screening) के लिए कितना विश्वसनीय है, जो ड्रग डिस्कवरी में हजारों यौगिकों को जल्दी से छानने के लिए उपयोग किया जाने वाला एक मानक है। उन्होंने जो स्कोर प्राप्त किया वह बड़े पैमाने पर परीक्षण के लिए आवश्यक सीमा से काफी ऊपर था, जो यह सुझाव देता है कि यह विधि औद्योगिक उपयोग के लिए पर्याप्त मजबूत है। उन्होंने यह भी नोट किया कि जबकि यह विधि यह मापने के लिए उत्कृष्ट है कि एक एंजाइम कितनी तेजी से काम करता है या एक दवा इसे कैसे रोकती है, यह उन्हें टूटे हुए टुकड़ों की सटीक रासायनिक संरचना नहीं बता सकती, जो अभी भी अधिक जटिल उपकरणों का काम है।
यह कार्य बैक्टीरिया की कोशिका भित्ति का अध्ययन करने के तरीके में एक व्यावहारिक बदलाव का प्रतिनिधित्व करता है। बैक्टीरिया को विकास के दौरान कैसे खिलाया जाता है, इसे बदलकर टीम ने एक ऐसा उपकरण बनाया है जो एक जटिल जैविक समस्या को एक सरल प्रकाश माप में बदल देता है। यह शोधकर्ताओं को एक ही समय में कई अलग-अलग एंजाइमों और बैक्टीरिया की दीवारों के संयोजन का परीक्षण करने की अनुमति देता है, जिससे इन सूक्ष्म निर्माण दलों के संचालन को समझने की प्रक्रिया तेज हो जाती है। हालांकि यह विधि क्षेत्र की हर समस्या को हल नहीं करती है, लेकिन यह बैक्टीरिया के विकास को बाधित करने के नए तरीकों की स्क्रीनिंग के लिए एक स्पष्ट, कुशल और लागत प्रभावी तरीका प्रदान करती है। वैज्ञानिकों के लिए जो अगली पीढ़ी के एंटीबायोटिक्स की तलाश में हैं, उनके पास एक ऐसा उपकरण होना जो इन आवश्यक एंजाइमों की गतिविधि को तेजी से और सटीक रूप से माप सके, जीवन रक्षक दवाओं की खोज को तेज कर सकता है।
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