Development of a high throughput continuous fluorescence anisotropy-based assay to analyse peptidoglycan-digesting enzymes
Dit artikel presenteert een robuuste, hoogdoorvoefluorescentie-anisotropie-assay met behulp van natuurlijk fluorescerend gelabeld peptidoglycaan om technische uitdagingen bij het bestuderen van bacteriële celwandenzymen te overwinnen en de ontdekking van nieuwe antimicrobiële verbindingen te versnellen.
Oorspronkelijk artikel gelicentieerd onder CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dit is een AI-gegenereerde uitleg van een preprint die niet peer-reviewed is. Dit is geen medisch advies. Neem geen gezondheidsbeslissingen op basis van deze inhoud. Lees de volledige disclaimer
Bacteriën zijn microscopische overlevers, maar ze leven in een constante staat van hoge druk. Binnenin hun piepkleine lichamen duwt de vloeistof naar buiten met genoeg kracht om ze te laten barsten als een overvolle ballon. Om te overleven, bouwen ze een stevige, gaasachtige schil om zich heen, een structuur gemaakt van suikerketens en peptideverbindingen die fungeert als zowel een skelet als een drukpak. Deze schil, bekend als peptidoglycaan, is geen statische muur; deze moet constant worden gerepareerd, herschapen en uitgebreid terwijl de bacterie groeit en deelt. Gespecialiseerde enzymen fungeren als de bouwploeg, waarbij ze het materiaal snijden en plakken om de perfecte balans tussen sterkte en flexibiliteit te behouden. Als deze enzymen defect raken, faalt de celwand en sterft de bacterie. Omdat dit proces zo essentieel is, hebben wetenschappers lang naar deze enzymen gekeken als doelwitten voor nieuwe antibiotica, in de hoop de bouwploeg te stoppen en de druk te laten winnen. Het bestuderen van deze enzymen is echter berucht moeilijk gebleken. De schil waar ze aan werken is een complex, onoplosbaar polymeer dat weerstand biedt aan standaard laboratoriumtests, waardoor onderzoekers gedwongen zijn terug te vallen op trage, arbeidsintensieve methoden die het moeilijk maken om snel naar nieuwe medicijnen te zoeken.
Een team onderzoekers aan de Universiteit van Warwick heeft een nieuwe manier ontwikkeld om deze enzymen aan het werk te zien, waarbij ze een traag, wazig proces veranderden in een snelle, heldere meting. In plaats van te proberen de minuscule stukjes van de schil uiteen te laten vallen onder een microscoop of ze te scheiden met complexe machines, besloot het team de schil zelf te laten gloeien. Ze kweekten bacteriën in een voedingsbad met een speciale, fluorescerende versie van een bouwsteen genaamd D-alanine. Terwijl de bacteriën hun wanden bouwden, incorporeerden ze onbewust deze gloeiende blokjes in het gaas. De onderzoekers oogstten vervolgens deze gloeiende schillen, maakten ze schoon en gebruikten ze als substraat voor hun experimenten. Wanneer ze de enzymen toevoegden die normaal gesproken de wand verteren, braken de gloeiende stukjes uiteen in kleinere fragmenten. In de wereld van de lichtfysica draaien grote moleculen langzaam in een vloeistof, terwijl kleine moleculen snel draaien. Door gepolariseerd licht op het mengsel te schijnen en te meten hoe het licht terugkaatste, kon het team direct zien of de gloeiende schil nog steeds een grote, langzaam draaiende structuur was of dat hij was gehakt in snel draaiende stukjes. Deze verandering in het lichtsignaal bood een directe, real-time aflezing van de activiteit van het enzym.
De onderzoekers testten deze methode op peptidoglycaan van vier zeer verschillende soorten bacteriën: een veelvoorkomende darmbacterie, twee soorten stafylokokken en streptokokken, en een taai, wasachtig bacterie dat ernstige infecties veroorzaakt. Ze ontdekten dat de gloeiende schillen perfect werkten als substraat voor een verscheidenheid aan enzymen. Wanneer ze een enzym toevoegden dat bekend staat om het doorsnijden van de suikerketens, daalde het lichtsignaal onmiddellijk, wat aangaf dat de wand werd afgebroken. Wanneer ze een enzym toevoegden dat alleen op een specifiek type bacteriële wand werkt, veranderde het signaal alleen voor die specifieke wand, wat bewees dat de methode onderscheid kon maken tussen verschillende biologische doelwitten. Het systeem was snel genoeg om tientallen tests in een enkele plaat uit te voeren, waardoor een analyse in minuten werd voltooid die met traditionele technieken uren zou hebben geduurd. Het team demonstreerde ook dat de methode remmers kon detecteren, stoffen die de enzymen stoppen met werken. Wanneer ze een chemische stof toevoegden die een specifiek enzym blokkeert, bleef de gloeiende schil intact en bleef het lichtsignaal stabiel, wat bevestigde dat het enzym succesvol was uitgeschakeld.
Deze benadering biedt een aanzienlijk voordeel ten opzichte van de oude manieren om enzymactiviteit te meten, die vaak vertrouwden op het meten van hoe troebel een oplossing werd naarmate de wand oploste. Die oude methode was traag en gaf vaak vage resultaten, waardoor het moeilijk was om subtiele verschillen op te merken of grote aantallen potentiële medicijnkandidaten snel te testen. De nieuwe fluorescentiemethode is precies en gevoelig, in staat om zelfs kleine veranderingen in de grootte van de moleculen te detecteren. De onderzoekers berekenden een statistische score om aan te tonen hoe betrouwbaar de test is voor high-throughput screening, een standaard in de geneesmiddelenontwikkeling om duizenden verbindingen snel te filteren. De score die zij behaalden lag ruim boven de drempel die als noodzakelijk wordt beschouwd voor dergelijke grootschalige tests, wat suggereert dat de methode robuust genoeg is voor industrieel gebruik. Ze merkten ook op dat hoewel de methode uitstekend is voor het meten van hoe snel een enzym werkt of hoe goed een medicijn het remt, het hen niet de exacte chemische structuur van de afgebroken stukjes kan vertellen, een taak die nog steeds complexere apparatuur vereist.
Het werk vertegenwoordigt een praktische verschuiving in de manier waarop wetenschappers de bacteriële celwand kunnen bestuderen. Door simpelweg te variëren in hoe de bacteriën tijdens de groei worden gevoed, creëerde het team een instrument dat een complex biologisch probleem verandert in een eenvoudige lichtmeting. Dit stelt onderzoekers in staat om veel verschillende combinaties van enzymen en bacteriële wanden tegelijkertijd te testen, waardoor het proces van het begrijpen van hoe deze microscopische bouwploegen opereren wordt versneld. Hoewel de methode niet elk probleem in het vakgebied oplost, biedt het een heldere, efficiënte en kosteneffectieve manier om te screenen op nieuwe manieren om de bacteriële groei te verstoren. Voor wetenschappers die op zoek zijn naar de volgende generatie antibiotica, kan het hebben van een instrument dat de activiteit van deze essentiële enzymen snel en nauwkeurig kan meten, de ontdekking van levensreddende medicijnen versnellen.
Verdrinkt u in papers in uw vakgebied?
Ontvang dagelijkse digests van de nieuwste papers die bij uw onderzoekswoorden passen — met technische samenvattingen, in uw taal.