Development of a high throughput continuous fluorescence anisotropy-based assay to analyse peptidoglycan-digesting enzymes

Les bactéries sont des survivantes microscopiques, mais elles vivent dans un état de pression constante et élevée. À l'intérieur de leurs corps minuscules, le fluide pousse vers l'extérieur avec une force suffisante pour les faire éclater comme un ballon surpressurisé. Pour survivre, elles construisent une coque robuste, semblable à un treillis, autour d'elles, une structure composée de chaînes de sucres et de liaisons peptidiques qui fait à la fois office de squelette et de combinaison de protection contre la pression. Cette coque, connue sous le nom de peptidoglycane, n'est pas un mur statique ; elle doit être constamment réparée, remodelée et agrandie à mesure que la bactérie grandit et se divise. Des enzymes spécialisées agissent comme une équipe de construction, coupant et collant le matériau pour maintenir l'équilibre parfait entre force et flexibilité. Si ces enzymes dysfonctionnent, la paroi cellulaire échoue et la bactérie meurt. Parce que ce processus est si vital, les scientifiques considèrent depuis longtemps ces enzymes comme des cibles pour de nouveaux antibiotiques, espérant arrêter l'équipe de construction et laisser la pression l'emporter. Cependant, l'étude de ces enzymes s'est avérée particulièrement difficile. La coque sur laquelle elles travaillent est un polymère complexe et insoluble qui résiste aux tests de laboratoire standards, forçant les chercheurs à compter sur des méthodes lentes et laborieuses qui rendent difficile le criblage rapide de nouveaux médicaments.

Une équipe de chercheurs de l'Université de Warwick a développé une nouvelle façon d'observer ces enzymes en action, transformant un processus lent et flou en une mesure rapide et claire. Au lieu d'essayer de voir les minuscules morceaux de la coque se briser sous un microscope ou de les séparer avec des machines complexes, l'équipe a décidé de faire en sorte que la coque elle elle-même devienne luminescente. Ils ont cultivé des bactéries dans un bain nutritif contenant une version fluorescente spéciale d'un bloc de construction appelé D-alanine. Pendant que les bactéries construisaient leurs parois, elles intégraient sans le savoir ces blocs lumineux dans le treillis. Les chercheurs ont ensuite récolté ces coques lumineuses, les ont nettoyées et les ont utilisées comme substrat pour leurs expériences. Lorsqu'ils ont ajouté les enzymes qui digèrent normalement la paroi, les morceaux lumineux se sont brisés en fragments plus petits. Dans le monde de la physique de la lumière, les grosses molécules tournent lentement dans un liquide, tandis que les petites molécules tournent rapidement. En projetant une lumière polarisée sur le mélange et en mesurant la façon dont la lumière rebondissait, l'équipe pouvait instantanément dire si la coque lumineuse était toujours une structure large et à rotation lente ou si elle avait été découpée en morceaux à rotation rapide. Ce changement dans le signal lumineux fournissait une lecture directe et en temps réel de l'activité de l'enzyme.

Les chercheurs ont testé cette méthode sur le peptidoglycane de quatre types de bactéries très différents : une bactérie intestinale commune, deux types de bactéries staphylocoques et streptocoques, ainsi qu'une bactérie coriace et cireuse qui provoque de graves infections. Ils ont constaté que les coques lumineuses fonctionnaient parfaitement comme substrat pour une variété d'enzymes. Lorsqu'ils ajoutaient une enzyme connue pour couper les chaînes de sucre, le signal lumineux chutait immédiatement, indiquant que la paroi se décomposait. Lorsqu'ils ajoutaient une enzyme qui ne travaille que sur un type spécifique de paroi bactérienne, le signal ne changeait que pour cette paroi spécifique, prouvant que la méthode pouvait distinguer différents cibles biologiques. Le système était assez rapide pour effectuer des dizaines de tests sur une seule plaque, complétant une analyse en quelques minutes là où les techniques traditionnelles auraient pris des heures. L'équipe a également démontré que la méthode pouvait détecter des inhibiteurs, des substances qui empêchent les enzymes de fonctionner. Lorsqu'ils ont ajouté un produit chimique connu pour bloquer une enzyme spécifique, la coque lumineuse est restée intacte et le signal lumineux est resté stable, confirmant que l'enzyme avait été désactivée avec succès.

Cette approche offre un avantage significatif par rapport aux anciennes méthodes de mesure de l'activité enzymatique, qui reposaient souvent sur la mesure de l'opacité d'une solution à mesure que la paroi se dissolvait. Cette ancienne méthode était lente et donnait souvent des résultats flous, ce qui rendait difficile la détection de différences subtiles ou le test rapide d'un grand nombre de candidats médicaments potentiels. La nouvelle méthode de fluorescence est précise et sensible, capable de détecter même de petits changements dans la taille des molécules. Les chercheurs ont calculé un score statistique pour montrer la fiabilité du test pour le criblage à haut débit, une norme utilisée dans la découverte de médicaments pour filtrer rapidement des milliers de composés. Le score qu'ils ont obtenu était bien au-dessus du seuil considéré comme nécessaire pour de tels tests à grande échelle, suggérant que la méthode est suffisamment robuste pour une utilisation industrielle. Ils ont également noté que, bien que la méthode soit excellente pour mesurer la vitesse à laquelle une enzyme travaille ou l'efficacité d'un médicament pour l'arrêter, elle ne peut pas leur indiquer la structure chimique exacte des morceaux brisés, une tâche qui nécessite encore des équipements plus complexes.

Ce travail représente un changement pratique dans la manière dont les scientifiques peuvent étudier la paroi cellulaire bactérienne. En changeant simplement la façon dont les bactéries sont nourries pendant leur croissance, l'équipe a créé un outil qui transforme un problème biologique complexe en une simple mesure de lumière. Cela permet aux chercheurs de tester de nombreuses combinaisons d'enzymes et de parois bactériennes en même temps, accélérant le processus de compréhension du fonctionnement de ces équipes de construction microscopiques. Bien que la méthode ne résolve pas tous les problèmes du domaine, elle offre un moyen clair, efficace et rentable de rechercher de nouvelles façons de perturber la croissance bactérienne. Pour les scientifiques à la recherche de la prochaine génération d'antibiotiques, disposer d'un outil capable de mesurer rapidement et précisément l'activité de ces enzymes essentielles pourrait accélérer la découverte de médicaments vitaux.