Development of a high throughput continuous fluorescence anisotropy-based assay to analyse peptidoglycan-digesting enzymes

박테리아는 미세한 생존자이지만, 그들은 끊임없이 높은 압력 상태에서 살아갑니다. 그들의 작은 몸 안에서는 내부의 액체가 마치 과하게 부풀려진 풍선처럼 터져버릴 만큼 강력한 힘으로 바깥쪽을 밀어냅니다. 살아남기 위해 박테리아는 자신을 둘러싸는 단단하고 그물 같은 껍질을 만드는데, 이 구조는 당 사슬과 펩타이드 결합으로 만들어진 것으로 골격이자 압력 보호복 역할을 합니다. 펩티도글리칸(peptidoglycan)이라고 알려진 이 껍질은 정지된 벽이 아닙니다. 박테리아가 성장하고 분열함에 따라 이 구조는 끊임없이 수리되고, 형태가 바뀌며, 확장되어야 합니다. 특화된 효소들이 건설팀 역할을 하며, 강도와 유연성 사이의 완벽한 균형을 유지하기 위해 재료를 자르고 붙입니다. 만약 이 효소들이 제대로 작동하지 않으면 세포벽이 무너지고 박테리아는 죽게 됩니다. 이 과정이 매우 중요하기 때문에, 과학자들은 오랫동안 이 효소들을 새로운 항생제의 표적으로 삼아, 건설팀을 멈춰 세워 압력이 승리하게 만들기를 희망해 왔습니다. 하지만 이 효소들을 연구하는 것은 매우 어려운 일로 알려져 왔습니다. 그들이 작업하는 껍질은 복잡하고 불용성인 고분자라서 표준 실험실 테스트를 거부하며, 이로 인해 연구자들은 새로운 약물을 빠르게 스크리닝하는 것을 어렵게 만드는 느리고 노동 집약적인 방법에 의존해야만 했습니다.

워릭 대학교의 연구진은 이 효소들이 작동하는 모습을 관찰하는 새로운 방법을 개발하여, 느리고 흐릿한 과정을 빠르고 명확한 측정법으로 바꾸어 놓았습니다. 연구진은 현미경으로 껍질의 미세한 조각들이 부서지는 것을 보거나 복잡한 기계로 분리하려고 시도하는 대신, 껍질 자체가 빛을 내도록 만들기로 결정했습니다. 그들은 D-알라닌(D-alanine)이라는 구성 성분의 특수한 형광 버전을 포함한 영양 배지에서 박테리아를 배양했습니다. 박테리아가 벽을 쌓는 동안, 박테리아는 자신도 모르게 이 빛나는 블록들을 그물 구조 안에 통합했습니다. 연구진은 이렇게 만들어진 빛나는 껍질을 수확하고 깨끗이 세척한 뒤, 실험의 기질(substrate)로 사용했습니다. 연구진이 원래 벽을 소화하는 효소들을 첨가하자, 빛나는 조각들이 더 작은 파편들로 부서졌습니다. 빛의 물리학 세계에서 큰 분자는 액체 속에서 느리게 회전하고, 작은 분자는 빠르게 회전합니다. 혼합물에 편광을 비추고 빛이 어떻게 반사되는지를 측정함으로써, 연구진은 빛나는 껍질이 여전히 크고 느리게 회전하는 구조인지, 아니면 빠르게 회성하는 작은 조각들로 잘렸는지를 즉각적으로 알 수 있었습니다. 이 빛의 신호 변화는 효소의 활성을 직접적이고 실시간으로 보여주는 판독값이 되었습니다.

연구진은 이 방법을 네 가지 매우 다른 유형의 박테리아(일반적인 장내 박테리아, 두 종류의 황색포도상구균 및 연쇄상구균, 그리고 심각한 감염을 일으키는 단단하고 왁스질인 박테리아)의 펩티도글리칸에 대해 테스트했습니다. 그들은 빛나는 껍질이 다양한 효소에 대한 기질로서 완벽하게 작동한다는 것을 발견했습니다. 당 사슬을 절단하는 것으로 알려진 효소를 첨가했을 때, 빛의 신호는 즉시 떨어졌으며 이는 벽이 붕괴되고 있음을 나타냈습니다. 특정 유형의 박테리아 벽에만 작용하는 효소를 첨가했을 때, 신호는 오직 그 특정 벽에 대해서만 변했는데, 이는 이 방법이 서로 다른 생물학적 표적을 구별할 수 있음을 증명했습니다. 이 시스템은 한 번에 수십 개의 테스트를 하나의 플레이트에서 실행할 수 있을 만큼 빨랐으며, 전통적인 기술로는 몇 시간이 걸렸을 분석을 단 몇 분 만에 완료했습니다. 또한 연구진은 이 방법이 효소의 작용을 막는 물질인 억제제(inhibitors)를 감지할 수 있다는 것을 입증했습니다. 특정 효소를 차단하는 것으로 알려진 화학 물질을 첨가했을 때, 빛나는 껍질은 온전하게 유지되었고 빛의 신호는 안정적으로 유지되었는데, 이는 효소가 성공적으로 무력화되었음을 확인시켜 주었습니다.

이 접근 방식은 벽이 용해됨에 따라 용액이 얼마나 탁해지는지를 측정하는 데 의존했던 기존의 방식보다 상당한 이점을 제공합니다. 기존 방식은 느리고 종종 흐릿한 결과를 주었기에, 미세한 차이를 포착하거나 많은 수의 잠재적 약물 후보를 빠르게 테스트하는 것을 어렵게 만들었습니다. 새로운 형광 방식은 정밀하고 민감하며, 분자의 크기 변화까지도 감지할 수 있습니다. 연구진은 이 테스트가 고처리량 스크리닝(high-throughput screening, 수천 개의 화합물을 빠르게 걸러내는 데 사용되는 약물 발견의 표준)에 얼마나 신뢰할 수 있는지 보여주기 위해 통계적 점수를 계산했습니다. 그들이 달성한 점수는 대규모 테스트에 필요한 기준치를 훨씬 상회했으며, 이는 이 방법이 산업적 용도로 사용될 만큼 견고하다는 것을 시사합니다. 또한 연구진은 이 방법이 효소가 얼마나 빨리 작동하는지 또는 약물이 효소를 얼마나 잘 차단하는지를 측정하는 데는 뛰어나지만, 부서진 조각들의 정확한 화학적 구조를 알려줄 수는 없으며, 그 역할은 여전히 더 복잡한 장비를 필요로 한다는 점을 언급했습니다.

이 연구는 과학자들이 박테리아 세포벽을 연구하는 방식의 실질적인 변화를 나타냅니다. 박테리아에게 공급되는 영양분을 바꾸는 것만으로, 연구진은 복잡한 생물학적 문제를 단순한 빛 측정값으로 전환하는 도구를 만들어냈습니다. 이를 통해 연구자들은 다양한 효소와 박테리아 벽의 조합을 동시에 테스트할 수 있으며, 이 미세한 건설팀이 어떻게 작동하는지에 대한 이해 과정을 가속화할 수 있습니다. 이 방법이 이 분야의 모든 문제를 해결하는 것은 아니지만, 박테리아의 성장을 방해하는 새로운 방법을 스크리닝할 수 있는 명확하고 효율적이며 비용 효율적인 방법을 제공합니다. 차세대 항생제를 찾는 과학자들에게, 이러한 필수 효소의 활성을 빠르고 정확하게 측정할 수 있는 도구를 갖는 것은 생명을 구하는 신약의 발견을 앞당길 수 있는 일이 될 것입니다.