Development of a high throughput continuous fluorescence anisotropy-based assay to analyse peptidoglycan-digesting enzymes
本文介绍了一种利用天然荧光标记的肽聚糖构建的稳健、高通量连续荧光各向异性分析方法，旨在克服研究细菌细胞壁酶过程中的技术挑战，并加速新型抗微生物化合物的发现。
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细菌是微小的生存者，但它们始终处于高压状态。在它们娇小的体内，流体向外挤压的力量足以让它们像充气过度的气球一样爆裂。为了生存，它们在自身周围构建了一层坚韧的网状外壳，这种结构由糖链和肽键组成，既是骨架，也是压力服。这种被称为肽聚糖的外壳并非静止的墙壁；随着细菌的生长和分裂，它必须不断地进行修复、重塑和扩张。专门的酶充当了施工队的角色，通过切割和粘贴材料来维持强度与柔韧性之间的完美平衡。如果这些酶发生故障，细胞壁就会失效，细菌随之死亡。由于这一过程至关重要，科学家长期以来一直将这些酶视为新型抗生素的目标，希望通过阻止这支“施工队”来让压力最终获胜。然而，研究这些酶一直非常困难。它们所工作的外壳是一种复杂的、不溶性的聚合物，难以通过标准的实验室测试，迫使研究人员依赖于缓慢且耗费人力的传统方法，这使得快速筛选新药变得十分困难。
华威大学的一个研究小组开发出了一种观察这些酶工作的新方法，将一个缓慢且模糊的过程转变为快速、清晰的测量。他们没有尝试在显微镜下观察这些微小外壳碎裂的过程，也没有使用复杂的机器将其分离，而是决定让外壳本身“发光”。他们在含有一种名为D-丙氨酸（D-alanine）的特殊荧光版本构建模块的营养液中培养细菌。随着细菌构建它们的细胞壁，它们会在不知不觉中将这些发光的模块整合进网格中。随后，研究人员收集这些发光的外壳，对其进行清理，并将其作为实验的底物。当他们加入通常用于消化细胞壁的酶时，发光的碎片会破碎成更小的部分。在光物理学领域，大分子在液体中旋转得慢，而小分子旋转得快。通过向混合物照射偏振光并测量反射回来的光，团队可以立即判断发光外壳是仍处于大型、慢速旋转的结构状态，还是已经被切割成了快速旋转的小碎片。这种光信号的变化为酶的活性提供了直接、实时的读数。
研究人员在四种截然不同的细菌肽聚糖上测试了这种方法：一种常见的肠道细菌，两种金黄色葡萄球菌和链球菌，以及一种会导致严重感染的坚硬、多蜡质细菌。他们发现，发光外壳可以完美地作为各种酶的底物。当他们加入一种已知能切割糖链的酶时，光信号立即下降，表明细胞壁正在分解。当他们加入一种仅针对特定类型细菌壁起作用的酶时，信号仅针对该特定壁发生了变化，这证明了该方法能够区分不同的生物靶点。该系统运行速度极快，可以在单个培养板中进行数十次测试，在几分钟内即可完成传统技术需要数小时才能完成的分析。团队还展示了该方法可以检测抑制剂（即阻止酶工作的物质）。当他们加入一种已知能阻断特定酶的化学物质时，发光外壳保持完整，光信号保持稳定，从而证实了该酶已被成功禁用。
这种方法相比于传统的测量酶活性的方式具有显著优势，旧方法通常依赖于测量溶液在细胞壁溶解过程中变得多么“浑浊”。旧方法速度缓慢且结果模糊，难以观察到细微差异或快速测试大量潜在候选药物。这种新的荧光法精确且灵敏，能够检测到分子大小的微小变化。研究人员计算了一个统计得分来展示该测试在药物研发中进行高通量筛选的可靠性——这是用于快速过滤数千种化合物的标准。他们获得的得分远高于大规模测试所需的阈值，表明该方法足以胜任工业化应用。他们还指出，虽然该方法在测量酶的工作速度或药物阻断效果方面表现出色，但它无法告诉他们破碎碎片的精确化学结构，这仍需依靠更复杂的设备。
这项工作代表了研究细菌细胞壁方式的一次实用转变。通过简单地改变细菌生长期间的“喂养”方式，该团队创造了一个工具，将复杂的生物学问题转化为简单的光测量。这使得研究人员可以同时测试多种酶与细菌壁的组合，从而加速理解这些微观“施工队”运作方式的过程。虽然该方法并未解决该领域的全部问题，但它提供了一种清晰、高效且具有成本效益的方法，用于筛选破坏细菌生长的各种新途径。对于正在寻找下一代抗生素的科学家来说，拥有一个能够快速、准确测量这些关键酶活性的工具，可以加速救命药物的发现进程。
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