Application of the ORBIT Protocol for Targeted Gene Deletion to Mycobacterium abscessus

تُعد البكتيريا أستاذة في البقاء، فهي تتطور باستمرار لمقاومة الأدوية المصممة لقتلها. ومن بين أكثر هذه الكائنات هيبة هي المتفطرات (mycobacteria)، وهي عائلة من الميكروبات القوية ذات الغلاف الشمعي، والتي تضم الكائن المسؤول عن مرض السل. وقد برز قريب لها، وهو "المتفطرة المعبسة" (Mycobacterium abscessus)، كخصم خطير بشكل خاص، حيث يسبب عدوى شديدة في الرئة والجلد يصعب علاجها بشكل ملحوظ. تحمل هذه البكتيريا مقاومة طبيعية مدمجة للعديد من المضادات الحيوية، مما يجعل العلاجات القياسية غير فعالة في كثير من الأحيان. ولفهم كيفية بقاء هذا الممرض وإيجاد طرق جديدة لإيقافه، يحتاج العلماء إلى دراسة جيناتها؛ إذ يجب أن يكونوا قادرين على إيقاف جينات معينة، واحداً تلو الآخر، لمعرفة ما يحدث للبكتيريا عندما تغيب تلك التعليمات الجينية. ومع ذلك، فإن القيام بذلك في بكتيريا M. abscessus يشبه محاولة تحرير مستند بلغة لا تتقنها تماماً؛ فالأدوات التي تعمل بشكل مثالي على بكتيريا أخرى غالباً ما تفشل هنا، مما يترك الباحثين غير قادرين على الحصول على النتائج الدقيقة التي يحتاجونها.

لقد قام فريق من الباحثين في جامعة روتجرز هيلث (Rutgers Health) الآن بتطوير أداة جينية قوية تسمى ORBIT لتعمل بشكل موثوق مع بكتيريا Mycobacterium abscessus. يعمل نظام ORBIT مثل المشرط الجزيئي، مما يسمح للعلماء بحذف أقسام محددة من الجينوم البكتيري بدقة عالية. وتتضمن العملية خطوتين رئيسيتين: أولاً، يتم إدخال بلازميد مساعد إلى البكتيريا لتوفير الآلية الداخلية اللازمة لقبول المادة الوراثية الجديدة. يقوم هذا البلازميد بتشفير إنزيمات محددة، وهي "Che9c phage RecT annealase" و"Bxb1 phage integrase"، التي تسهل عملية التحرير. ثانياً، يتم إرسال قطعة مصممة خصيصاً من الشفرة الوراثية، تُعرف باسم "القطع القليل النيوكليوتيد" (oligonucleotide)، جنباً إلى جنب مع بلازميد "الحمولة" (payload). تم تصميم هذا القطع القليل النيوكليوتيد ليتطابق مع الحمض النووي المحيط بالجين المستهدف، مما يوجه الآلية البكتيرية لاستبدال الجين غير المرغوب فيه بالحمولة، التي تحمل علامة لتحديد عمليات التحرير الناجحة. وبينما استُخدم هذا النظام بنجاح على أنواع أخرى من المتفطرات، وجد الباحثون أن مجرد تطبيق التعليمات الموجودة على M. abscessus لم ينجح؛ فقد كانت البكتيريا مقاومة جداً لعلامات الاختيار القياسية، ولم تكن الأدلة الجينية دقيقة بما يكفي لتحقيق نتائج نظيفة.

بدأ الباحثون بمعالجة مشكلة الاختيار. في محاولاتهم الأولية لحذف جين معين، استخدموا علامة تجعل البكتيريا مقاومة لمضاد حيوي يسمى "هيغرومايسين" (hygromycin). توقعوا أن البكتيريا التي نجحت في حذف الجين فقط هي التي ستنمو عند وضعها في طبق يحتوي على هذا العقار. وبدلاً من ذلك، نمت مجموعة البكتيريا بأكملها، بغض النظر عما إذا كانت قد عُدلت أم لا. حدث هذا لأن M. abscessus تقاوم الهيغرومايسين طبيعياً، مما جعل عملية الاختيار عديمة الفائدة. أدرك الفريق أنه يتعين عليهم العثور على مضاد حيوي مختلف لا تستطيع البكتيريا مقاومته بمفردها. فاستبدلوا ذلك بعقار يسمى "زيوسين" (zeocin). وعندما استخدموا بلازميد حمولة يحمل علامة مقاومة الزيوسين، تغيرت النتائج بشكل كبير؛ حيث نجت فقط البكتيريا التي دمجت المادة الوراثية الجديدة بنجاح، مما سمح للباحثين بعزل ودراسة الطفرات الصحيحة.

بعد ذلك، ركز الفريق على جودة الأدلة الجينية نفسها. تعتمد طريقة ORBIT على خيوط طويلة من الحمض النووي الاصطناعي، تسمى "القطع القليل النيوكليوتيد"، لتوجيه حذف الجين. واختبر الباحثون نسختين: خيطاً أقصر وخيطاً أطول. من الناحية النظرية، ينبغي أن تعمل الخيوط الأطول بشكل أفضل لأنها تتطابق مع الحمض النووي المستهدف بشكل أكثر شمولاً، لكن العملية الكيميائية المستخدمة لبنائها غالباً ما تؤدي إلى خليط من الخيوط المثالية والخيوط المكسورة أو غير المكتملة. وكلما زاد طول الخيط، زادت فرصة حدوث هذه الأخطاء. ولحل هذه المشكلة، استخدم الباحثون تقنية تنقية تسمى "PAGE" لتصفية الخيوط المكسورة والاحتفاظ فقط بالأدلة الكاملة والمثالية. وعندما قارنوا النتائج، أنتجت الأدلة الأقصر غير المنقاة العديد من المستعمرات البكتيرية، ولكن جزءاً صغيراً منها فقط كان يحتوي على حذف الجين الصحيح. في المقابل، أنتجت الأدلة الأطول والمنقاة عدداً أقل بكثير من المستعمرات الإجمالية، ولكن ثلاثة من كل أربعة مستعمرات تم فحصها احتوت على الحذف الدقيق الذي أراده العلماء. أظهر هذا الاكتشاف أن الجودة أهم بكثير من الكمية؛ إذ أدت مجموعة أصغر من الأدلة المثالية إلى نتائج أكثر موثوقية بكثير.

اكتشف الباحثون أيضاً أن تخطيط الجينوم البكتيري يتطلب عناية فائقة. فعندما حاولوا حذف جين معين، لاحظوا أن نهاية ذلك الجين تتداخل مع بداية جين مجاور على الشريط المقابل. فإذا قاموا بحذف الجين المستهدف بالكامل كما كان مخططاً له في الأصل، فسوف يتسببون في تلف الجين المجاور عن طريق الخطأ، مما يجعل من المستحيل معرفة ما إذا كانت التأثيرات الملحوظة ناتجة عن فقدان الجين المستهدف أم الجين المجاور. ولإصلاح ذلك، أعادوا تصميم أدلتهم الجينية بحيث تترك ذلك الجزء الصغير المتداخل سليماً. سمح هذا بإزالة الجين المستهدف مع الحفاظ على سلامة الجين المجاور. سلط هذا التعديل الضوء على درس حاسم: النجاح في التحرير الجيني يتطلب فهماً عميقاً للبنية المحددة لجينوم الكائن الحي، وليس مجرد تطبيق عام لبروتوكول ما.

أخيراً، أكد الفريق أن طريقتهم المحسنة تعمل في جميع الحالات. فقد طبقوا سير عملهم المنقح لحذف أربعة جينات إضافية، بما في ذلك تلك المشاركة في مقاومة البكتيريا للمضادات الحيوية. وفي كل حالة، سمح الجمع بين اختيار المضاد الحيوي الصحيح، واستخدام الأدلة الجينية الأطول والمنقاة، والتصميم الدقيق لحدود الحذف، بتوليد الطفرات المطلوبة. كما طوروا مجموعة من الاختبارات المحددة للتحقق من صحة التعديلات، لضمان أن البكتيريا لم تدمج الحمض النووي الجديد في مكان خاطٍ أو بشكل جزئي فقط. ومن خلال إنشاء هذا الإطار القوي والقابل للتكيف، وفر الباحثون للمجتمع العلمي وسيلة موثوقة للتلاعب بجينات هذا الممرض الصعب. ويفتح هذا التقدم الباب أمام تحقيقات أعمق في كيفية تسبب M. abscessus في المرض ومقاومتها للعلاج، مما يوفر مساراً أوضح نحو تطوير استراتيجيات جديدة لمكافحة هذه العدوى المستمرة.