Application of the ORBIT Protocol for Targeted Gene Deletion to Mycobacterium abscessus

Les bactéries sont des maîtres de la survie, évoluant constamment pour résister aux médicaments conçus pour les tuer. Parmi les plus redoutables d'entre elles figurent les mycobactéries, une famille de microbes robustes au revêtement cireux qui comprend l'organisme responsable de la tuberculose. Un proche parent, Mycobacterium abscessus, est apparu comme un adversaire particulièrement dangereux, provoquant de graves infections pulmonaires et cutanées notoirement difficiles à traiter. Cette bactérie possède une résistance naturelle intégrée à de nombreux antibiotiques, rendant les thérapies standards souvent inefficaces. Pour comprendre comment ce pathogène survit et trouver de nouveaux moyens de l'arrêter, les scientifiques doivent étudier ses gènes. Ils doivent être capables de désactiver des gènes spécifiques, un par un, pour voir ce qui arrive aux bactéries lorsque cette instruction génétique est manquante. Cependant, faire cela sur M. abscessus revient à essayer d'éditer un document dans une langue que l'on ne maîtrise pas totalement ; les outils qui fonctionnent parfaitement sur d'autres bactéries échouent souvent ici, laissant les chercheurs incapables d'obtenir les résultats précis dont ils ont besoin.

Une équipe de chercheurs de Rutgers Health a désormais perfectionné un outil génétique puissant appelé ORBIT pour qu'il fonctionne de manière fiable avec Mycobacterium abscessus. Le système ORBIT agit comme un scalpel moléculaire, permettant aux scientifiques de supprimer des sections spécifiques du génome bactérien avec une grande précision. Le processus comprend deux étapes principales : premièrement, un plasmide auxiliaire est introduit dans les bactéries pour fournir la machinerie interne nécessaire à l'acceptation de nouveau matériel génétique. Ce plasmide code pour les enzymes spécifiques, l'annealase RecT du phage Che9c et l'intégrase du phage Bxb1, qui facilitent le processus d'édition. Deuxièmement, un morceau de code génétique sur mesure, appelé oligonucléotide, est livré avec un plasmide « charge utile » (payload). Cet oligonucléotide est conçu pour correspondre à l'ADN entourant le gène cible, guidant la machinerie bactérienne pour remplacer le gène indésirable par la charge utile, laquelle transporte un marqueur pour identifier les éditions réussies. Bien que ce système ait été utilisé avec succès sur d'autres mycobactéries, les chercheurs ont constaté que l'application directe des instructions existantes sur M. abscessus ne fonctionnait pas. Les bactéries étaient trop résistantes aux marqueurs de sélection standards, et les guides génétiques n'étaient pas assez précis pour donner des résultats nets.

Les chercheurs ont commencé par s'attaquer au problème de la sélection. Dans leurs tentatives initiales pour supprimer un gène spécifique, ils ont utilisé un marqueur qui rendait les bactéries résistantes à un antibiotique appelé hygromycine. Ils s'attendaient à ce que seules les bactéries ayant réussi la délétion du gène survivent lorsqu'elles étaient placées sur une boîte contenant ce médicament. Au lieu de cela, toute la population de bactéries a crû, qu'elles aient été éditées ou non. Cela s'est produit parce que M. abscessus résiste naturellement à l'hygromycine, rendant le processus de sélection inutile. L'équipe a réalisé qu'elle devait trouver un antibiotique différent auquel les bactéries ne pourraient pas résister d'elles-mêmes. Ils sont passés à un médicament appelé zéocine. Lorsqu'ils ont utilisé un plasmide de charge utile portant un marqueur de résistance à la zéocine, les résultats ont changé radicalement. Seules les bactéries ayant réussi à incorporer le nouveau matériel génétique ont survécu, permettant aux chercheurs d'isoler et d'étudier les mutants corrects.

Ensuite, l'équipe s'est concentrée sur la qualité des guides génétiques eux-mêmes. La méthode ORBIT repose sur de longs brins d'ADN synthétique, appelés oligonucléotides, pour guider la suppression du gène. Les chercheurs ont testé deux versions : un brin plus court et un plus long. En théorie, les brins plus longs devraient mieux fonctionner car ils correspondent plus largement à l'ADN cible, mais le processus chimique utilisé pour les construire entraîne souvent un mélange de brins parfaits et de brins cassés ou incomplets. Plus le brin est long, plus la probabilité de ces erreurs est élevée. Pour résoudre ce problème, les chercheurs ont utilisé une technique de purification appelée PAGE pour filtrer les brins cassés et ne conserver que les guides parfaits et de pleine longueur. Lorsqu'ils ont comparé les résultats, les guides plus courts et non purifiés produisaient de nombreuses colonies bactériennes, mais seule une petite fraction d'entre elles présentait la délétion de gène correcte. En revanche, les guides plus longs et purifiés produisaient beaucoup moins de colonies au total, mais un nombre impressionnant de trois colonies sur quatre examinées contenaient la délétion exacte souhaitée par les scientifiques. Cette découverte a montré que la qualité importait bien plus que la quantité ; un nombre plus restreint de guides parfaits menait à des résultats beaucoup plus fiables.

Les chercheurs ont également découvert que la disposition du génome bactérien nécessitait une attention particulière. Lorsqu'ils ont tenté de supprimer un gène spécifique, ils ont remarqué que la fin de ce gène chevauchait le début d'un gène voisin sur le brin opposé. S'ils supprimeaient le gène cible entier comme prévu initialement, ils endommageraient accidentellement le voisin, rendant impossible de savoir si les effets observés étaient dus à la perte du gène cible ou du voisin. Pour corriger cela, ils ont redessiné leurs guides génétiques pour laisser cette petite section de chevauchement intacte. Cela leur a permis de supprimer le gène cible tout en préservant l'intégrité du gène adjacent. Cet ajustement a mis en lumière une leçon cruciale : une édition génétique réussie nécessite une compréhension profonde de l'architecture spécifique du génome de l'organisme, et non une simple application générique d'un protocole.

Enfin, l'équipe a confirmé que leur méthode optimisée fonctionnait de manière globale. Ils ont appliqué leur flux de travail raffiné pour supprimer quatre gènes supplémentaires, y compris ceux impliqués dans la résistance de la bactérie aux antibiotiques. Dans chaque cas, la combinaison de la sélection par antibiotique approprié, de l'utilisation de guides génétiques plus longs et purifiés, et de la conception prudente des limites de délétion leur a permis de générer les mutants souhaités. Ils ont également développé un ensemble de tests spécifiques pour vérifier que les éditions étaient correctes, s'assurant que les bactéries n'avaient pas accidentellement intégré le nouvel ADN au mauvais endroit ou de manière partielle. En établissant ce cadre robuste et adaptable, les chercheurs ont fourni à la communauté scientifique un moyen fiable de manipuler les gènes de ce pathogène difficile. Cette avancée ouvre la voie à des investigations plus approfondies sur la manière dont M. abscessus provoque des maladies et résiste aux traitements, offrant une voie plus claire vers le développement de nouvelles stratégies pour combattre ces infections persistantes.