Application of the ORBIT Protocol for Targeted Gene Deletion to Mycobacterium abscessus

I batteri sono maestri della sopravvivenza, costantemente in evoluzione per resistere ai medicinali progettati per ucciderli. Tra i più formidabili di questi ci sono i micobatteri, una famiglia di microbi resistenti e rivestiti da uno strato ceroso che include l'organismo responsabile della tubercolosi. Un parente stretto, il Mycobacterium abscessus, è emerso come un avversario particolarmente pericoloso, causando gravi infezioni polmonari e cutanee notoriamente difficili da trattare. Questo batterio possiede una resistenza naturale e intrinseca a molti antibiotici, rendendo spesso inefficaci le terapie standard. Per comprendere come questo patogeno sopravviva e per trovare nuovi modi per fermarlo, gli scienziati devono studiarne i geni. Devono essere in grado di spegnere specifici geni, uno alla volta, per vedere cosa succede al batterio quando quell'istruzione genetica viene a mancare. Tuttavia, farlo in M. abscessus è come cercare di modificare un documento in una lingua che non si parla completamente; gli strumenti che funzionano perfettamente su altri batteri spesso falliscono qui, lasciando i ricercatori impossibilitati a ottenere i risultati precisi di cui hanno bisogno.

Un team di ricercatori della Rutgers Health ha ora perfezionato uno strumento genetico potente chiamato ORBIT per farlo funzionare in modo affidabile con Mycobacterium abscessus. Il sistema ORBIT agisce come un bisturi molecolare, permettendo agli scienziati di eliminare sezioni specifiche del genoma batterico con alta precisione. Il processo prevede due fasi principali: prima, un plasmide di supporto viene introdotto nei batteri per fornire il macchinario interno necessario ad accettare nuovo materiale genetico. Questo plasmide codifica gli enzimi specifici, l'annealasi RecT del fago Che9c e l'integrasi del fago Bxb1, che facilitano il processo di editing. Secondo, un pezzo di codice genetico personalizzato, noto come oligonucleotide, viene consegnato insieme a un plasmide "payload". Questo oligonucleotide è progettato per corrispondere al DNA che circonda il gene bersaglio, guidando il macchinario batterico a sostituire il gene indesiderato con il payload, che trasporta un marcatore per identificare le modifiche avvenute con successo. Sebbene questo sistema fosse stato utilizzato con successo su altri micobatteri, i ricercatori hanno scoperto che l'applicazione diretta delle istruzioni esistenti a M. abscessus non funzionava. I batteri erano troppo resistenti ai marcatori di selezione standard e le guide genetiche non erano abbastanza precise da produrre risultati puliti.

I ricercatori iniziarono affrontando il problema della selezione. Nei loro tentativi iniziali di eliminare un gene specifico, usarono un marcatore che rendeva i batteri resistenti a un antibiotico chiamato igromicina. Si aspettavano che solo i batteri con la corretta delezione genica sarebbero sopravvissuti quando posti su una piastra contenente questo farmaco. Invece, l'intera popolazione di batteri cresceva, indipendentemente dal fatto che fossero stati modificati o meno. Ciò accadeva perché M. abscessus resiste naturalmente all'igromicina, rendendo inutile il processo di selezione. Il team si rese conto di dover trovare un antibiotco diverso che i batteri non potessero resistere autonomamente. Passarono a un farmaco chiamato zeocina. Quando usarono un plasmide payload contenente un marcatore di resistenza alla zeocina, i risultati cambiarono drasticamente. Solo i batteri che avevano incorporato con successo il nuovo materiale genetico sopravvvissero, permettendo ai ricercatori di isolare e studiare i mutanti corretti.

Successivamente, il team si concentrò sulla qualità delle guide genetiche stesse. Il metodo ORBIT si basa su lunghi filamenti di DNA sintetico, chiamati oligonucleoti, per guidare la delezione genica. I ricercatori testarono due versioni: un filamento più corto e uno più lungo. In teoria, i filamenti più lunghi dovrebbero funzionare meglio perché corrispondono al DNA bersaglio in modo più esteso, ma il processo chimico utilizzato per costruirli spesso produce una miscela di filamenti perfetti e filamenti rotti o incompleti. Più lungo è il filamento, maggiore è la probità di questi errori. Per risolvere il problema, i ricercatori utilizzarono una tecnica di purificazione chiamata PAGE per filtrare i filamenti rotti e mantenere solo le guide perfette e complete. Quando confrontarono i risultati, le guide più corte e non purificate produssero molte colonie batteriche, ma solo una piccola frazione di esse presentava la corretta delezione genica. Al contrario, le guide più lunghe e purificate produssero molte meno colonie complessivamente, ma un impressionante tre colonie su quattro esaminate contenevano l'esatta delezione desiderata dagli scienziati. Questa scoperta dimostrò che la qualità contava molto più della quantità; un numero minore di guide perfette portava a risultati molto più affidabili.

I ricercatori scoprirono anche che la disposizione del genoma batterico richiedeva un'attenzione meticolosa. Quando provarono a eliminare un gene specifico, notarono che la fine di quel gene si sovrapponeva all'inizio di un gene vicino sul filamento opposto. Se avessero eliminato l'intero gene bersaglio come pianificato originariamente, avrebbero accidentalmente danneggiato il vicino, rendendo impossibile capire se gli effetti osservati fossero dovuti alla perdita del gene bersaglio o del vicino. Per risolvere il problema, riprogettarono le loro guide genetiche per lasciare intatta quella piccola sezione sovrapposta. Ciò permise di rimuovere il gene bersaglio preservando l'integrità del gene adiacente. Questo aggiustamento evidenziò una lezione cruciale: l'editing genetico di successo richiede una profonda comprensione dell'architettura specifica del genoma dell'organismo, non solo un'applicazione generica di un protocollo.

Infine, il team confermò che il loro metodo ottimizzato funzionava in modo trasversale. Applicarono il loro flusso di lavoro perfezionato per eliminare quattro geni aggiuntivi, inclusi quelli coinvolti nella resistenza agli antibiotici. In ogni caso, la combinazione della corretta selezione antibiotica, l'uso di guide genetiche più lunghe e purificate e la progettazione attenta dei confini di delezione permise loro di generare i mutanti desiderati. Svilupparono anche un set di test specifici per verificare che le modifiche fossero corrette, assicurandosi che i batteri non avessero accidentalmente integrato il nuovo DNA nel posto sbagliato o solo parzialmente. Stabilendo questo quadro robusto e adattabile, i ricercatori hanno fornito alla comunità scientifica un modo affidabile per manipolare i geni di questo difficile patogeno. Questo progresso apre la porta a indagini più profonde su come M. abscessus causi malattie e resista ai trattamenti, offrendo una via più chiara verso lo sviluppo di nuove strategie per combattere queste persistenti infezioni.