Application of the ORBIT Protocol for Targeted Gene Deletion to Mycobacterium abscessus

박테리아는 생존의 명수이며, 자신들을 죽이도록 설계된 약물에 맞서 끊임없이 진화합니다. 이들 중 가장 강력한 것 중 하나는 결핵을 일으키는 미생물을 포함하는, 단단하고 왁스층으로 덮인 미생물 가족인 마이코박테리아(mycobacteria)입니다. 그 가까운 친척인 Mycobacterium abscessus는 특히 위험한 적수로 부상했으며, 치료가 매우 까다로운 심각한 폐 및 피부 감염을 일으킵니다. 이 박테리아는 많은 항생제에 대한 천연 내성을 지니고 있어, 표준 요법이 효과가 없는 경우가 많습니다. 이 병원체가 어떻게 생존하는지 이해하고 이를 저지할 새로운 방법을 찾기 위해, 과학자들은 이들의 유전자를 연구해야 합니다. 그들은 특정 유전자가 빠졌을 때 박테리아에 어떤 일이 일어나는지 확인하기 위해, 하나씩 특정 유전자를 꺼야 합니다. 하지만 M. abscessus에서 이 작업을 수행하는 것은 당신이 완전히 구사하지 못하는 언어로 된 문서를 편집하려는 것과 같습니다. 다른 박테리아에는 완벽하게 작동하는 도구들이 여기서는 실패하여, 연구자들이 필요한 정밀한 결과를 얻지 못하게 만듭니다.

럿거스 헬스(Rutgers Health)의 연구팀은 이제 ORBIT이라 불리는 강력한 유전 도구가 Mycobacterium abscessus에서 안정적으로 작동하도록 개선했습니다. ORBIT 시스템은 분자 메스처럼 작용하여, 과학자들이 박테리아 게놈의 특정 섹션을 높은 정밀도로 삭제할 수 있게 해줍니다. 이 과정은 두 단계로 이루어집니다. 먼저, 새로운 유전 물질을 받아들이는 데 필요한 내부 기제를 제공하기 위해 헬퍼 플라스미드(helper plasmid)를 박테리아에 도입합니다. 이 플라스미드는 편집 과정을 용이하게 하는 특정 효소인 Che9c 파지 RecT 아네레이스(annealase)와 Bxb1 파지 인테그레이스(integrase)를 인코딩합니다. 둘째, '페이로드(payload)' 플라스미드와 함께 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)라고 알려진 맞춤형 유전 코드를 전달합니다. 이 올리고뉴클레오타이드는 표적 유전자 주변의 DNA와 일치하도록 설계되어, 박테리아의 기제가 원하는 유전자를 성공적인 편집을 식별할 수 있는 마커를 가진 페이로드로 교체하도록 안내합니다. 이 시스템은 다른 마이코박테리아에는 성공적으로 사용되었지만, 연구진은 기존의 지침을 단순히 M. abscessus에 적용하는 것은 작동하지 않는다는 것을 발견했습니다. 박테리아가 표준 선택 마커에 너무 강한 내성을 가지고 있었고, 유전 가이드가 정밀하지 않아 깨끗한 결과를 얻을 수 없었기 때문입니다.

연구진은 먼저 선택(selection) 문제를 해결하는 것부터 시작했습니다. 특정 유전자를 삭제하려는 초기 시도에서, 그들은 박테리아를 하이그로마이신(hygromycin)이라는 항생제에 내성을 갖게 하는 마커를 사용했습니다. 그들은 하이그로마이신이 포함된 플레이트에 배양했을 때 성공적으로 유전자가 삭제된 박테리아만이 살아남을 것이라고 예상했습니다. 그러나 편집 여부와 상관없이 박테리아 전체 군집이 자라났습니다. 이는 M. abscessus가 자연적으로 하이그로마이신에 내성을 가지고 있어 선택 과정이 무용지물이 되었기 때문입니다. 연구팀은 박테리아가 스스로 저항할 수 없는 다른 항생제를 찾아야 한다는 것을 깨달았습니다. 그들은 제오신(zeocin)이라는 약물로 전환했습니다. 제오신 내성 마커를 가진 페이로드 플라스미드를 사용했을 때 결과는 극적으로 변했습니다. 성공적으로 새로운 유전 물질을 통합한 박테리아만이 살아남았고, 이를 통해 연구진은 올바른 돌연변이를 분리하고 연구할 수 있었습니다.

다음으로, 팀은 유전 가이드 자체의 품질에 집중했습니다. ORBIT 방식은 유전자 삭제를 안내하기 위해 올리고뉴클레오타이드라고 불리는 긴 합성 DNA 가닥에 의존합니다. 연구진은 짧은 가닥과 긴 가닥의 두 가지 버전을 테스트했습니다. 이론적으로는 긴 가닥이 표적 DNA와 더 광범위하게 일치하므로 더 잘 작동해야 하지만, 이를 만드는 화학적 과정에서 종종 완벽한 가닥과 부서지거나 불완전한 가닥이 섞인 혼합물이 만들어집니다. 가닥이 길수록 이러한 오류가 발생할 확률이 높아집니다. 이를 해결하기 위해 연구진은 부서진 가닥을 걸러내고 완벽한 전체 길이의 가이드만을 남기기 위해 PAGE라는 정제 기술을 사용했습니다. 결과를 비교했을 때, 정제되지 않은 짧은 가이드들은 많은 박테리아 군집을 생성했지만, 그중 아주 적은 부분만이 올바른 유전자 삭제를 포함하고 있었습니다. 반면, 정제된 긴 가이드는 전체적인 군집 수는 훨씬 적었지만, 스크리닝된 군집 4개 중 3개가 과학자들이 원했던 정확한 삭제를 포함하고 있었습니다. 이 발견은 양보다 질이 훨씬 중요하다는 것을 보여주었습니다. 즉, 더 적은 수의 완벽한 가이드가 훨씬 더 신뢰할 수 있는 결과를 낳는다는 것입니다.

연구진은 또한 박테리아 게놈의 배치(layout)에 세심한 주의가 필요하다는 것을 발견했습니다. 특정 유전자를 삭제하려고 했을 때, 해당 유전자의 끝부분이 반대편 가닥에 있는 이웃 유전자의 시작 부분과 겹쳐 있다는 것을 알아차렸습니다. 원래 계획대로 전체 표적 유전자를 삭제한다면, 이웃 유전자를 실수로 손상시켜 관찰된 효과가 표적 유전자의 상실 때문인지 아니면 이웃 유전 때문인지 구분할 수 없게 될 것이었습니다. 이를 해결하기 위해 연구진은 그 작은 겹치는 부분을 온전하게 남겨두도록 유전 가이드를 재설계했습니다. 이를 통해 표적 유전자를 제거하면서도 인접한 유전자의 무결성을 보존할 수 있었습니다. 이 조정은 성공적인 유전 편집을 위해서는 단순히 일반적인 프로토콜을 적용하는 것이 아니라, 해당 생명체의 특정 게놈 구조에 대한 깊은 이해가 필요하다는 중요한 교훈을 강조했습니다.

마สุดท้าย로, 팀은 최적화된 방법이 전반적으로 작동함을 확인했습니다. 그들은 정제된 워크플로우를 항생제 내성과 관련된 유전자를 포함한 4개의 추가 유전자를 삭제하는 데 적용했습니다. 모든 경우에서 올바른 항생제 선택, 길고 정제된 유전 가이드의 사용, 그리고 신중한 삭제 경계 설계의 조합을 통해 원하는 돌연변이를 생성할 수 있었습니다. 또한 그들은 편집이 정확하게 이루어졌는지 확인하기 위한 일련의 특정 테스트를 개발하여, 박테리아가 실수로 새로운 DNA를 잘못된 위치에 통합했거나 부분적으로만 통합하지 않았음을 보장했습니다. 이 견고하고 적응 가능한 프레임워크를 구축함으로써, 연구진은 과학계에 이 까다로운 병원체의 유전자를 조작할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법을 제공했습니다. 이 진보는 M. abscessus가 어떻게 질병을 일으키고 치료에 저항하는지에 대한 더 깊은 조사를 가능하게 하여, 이 지속적인 감염을 퇴치하기 위한 새로운 전략을 개발하는 데 더 명확한 길을 열어주었습니다.