Application of the ORBIT Protocol for Targeted Gene Deletion to Mycobacterium abscessus

Las bacterias son maestras de la supervivencia, evolucionando constantemente para resistir las medicinas diseñadas para matarlas. Entre las más formidables de estas se encuentran las micobacterias, una familia de microbios resistentes con una cubierta cerosa que incluye al organismo responsable de la tuberculosis. Un pariente cercano, Mycobacterium abscessus, ha surgido como un adversario particularmente peligroso, causando infecciones graves en los pulmones y la piel que son notablemente difíciles de tratar. Esta bacteria posee una resistencia natural e intrínseca a muchos antibióticos, lo que hace que las terapias estándar sean a menudo ineficaces. Para comprender cómo sobrevive este patógeno y encontrar nuevas formas de detenerlo, los científicos necesitan estudiar sus genes. Deben ser capaces de apagar genes específicos, uno por uno, para ver qué le sucede a la bacteria cuando falta esa instrucción genética. Sin embargo, hacer esto en M. abscessus es como intentar editar un documento en un idioma que no se habla completamente; las herramientas que funcionan perfectamente en otras bacterias suelen fallar aquí, dejando a los investigadores incapaces de obtener los resultados precisos que necesitan.

Un equipo de investigadores de Rutgers Health ha refinado ahora una poderosa herramienta genética llamada ORBIT para que funcione de manera fiable con Mycobacterium abscessus. El sistema ORBIT actúa como un escalpelo molecular, permitiendo a los científicos eliminar secciones específicas del genoma bacteriano con alta precisión. El proceso consta de dos pasos principales: primero, se introduce un plásmido de ayuda en las bacterias para proporcionar la maquinaria interna necesaria para aceptar nuevo material genético. Este plásmido codifica las enzimas específicas, la de la liga de recodificación de la proteína RecT del fago Che9c y la integrasa del fago Bxb1, que facilitan el proceso de edición. Segundo, se entrega un fragmento de código genético hecho a medida, conocido como oligonucleótido, junto con un plásmido de "carga útil" (payload). Este oligonucleótido está diseñado para coincidir con el ADN que rodea al gen objetivo, guiando la maquinaria bacteriana para sustituir el gen no deseado por la carga útil, la cual lleva un marcador para identificar las ediciones exitosas. Aunque este sistema se había utilizado con éxito en otras micobacterias, los investigadores descubrieron que la simple aplicación de las instrucciones existentes a M. abscessus no funcionaba. Las bacterias eran demasiado resistentes a los marcadores de selección estándar y las guías genéticas no eran lo suficientemente precisas para ofrecer resultados limpios.

Los investigadores comenzaron abordando el problema de la selección. En sus intentos iniciales de eliminar un gen específico, utilizaron un marcador que hacía a las bacterias resistentes a un antibiótico llamado higromicina. Esperaban que solo las bacterias con la eliminación exitosa del gen sobrevivieran al ser colocadas en una placa con este fármaco. En cambio, toda la población de bacterias creció, independientemente de si habían sido editadas o no. Esto sucedió porque M. abscessus es resistente a la higromicina de forma natural, lo que hace que el proceso de selección sea inútil. El equipo se dio cuenta de que debían encontrar un antibiótico diferente al que las bacterias no pudieran resistirse por sí mismas. Cambiaron a un fármaco llamado zeocina. Cuando utilizaron un plásmido de carga útil que portaba un marcador de resistencia a la zeocina, los resultados cambiaron drásticamente. Solo las bacterias que habían incorporado con éxito el nuevo material genético sobrevivieron, lo que permitió a los investigadores aislar y estudiar los mutantes correctos.

A continuación, el equipo se centró en la calidad de las propias guías genéticas. El método ORBIT depende de largas hebras de ADN sintético, llamadas oligonucleótidos, para guiar la eliminación del gen. Los investigadores probaron dos versiones: una hebra más corta y otra más larga. En teoría, las hebras más largas deberían funcionar mejor porque coinciden más extensamente con el ADN objetivo, pero el proceso químico utilizado para construirlas suele dar como resultado una mezcla de hebras perfectas e incompletas o rotas. Cuanto más larga es la hebra, mayor es la probabilidad de estos errores. Para solucionar esto, los investigadores utilizaron una técnica de purificación llamada PAGE para filtrar las hebras rotas y conservar solo las guías perfectas y de longitud completa. Cuando compararon los resultados, las guías más cortas y no purificadas produjeron muchas colonias bacterianas, pero solo una pequeña fracción de ellas tenía la eliminación de genes correcta. En contraste, las guías más largas y purificadas produjeron muchas menos colonias en total, pero un impresionante tres de cada cuatro colonias analizadas contenían la eliminación exacta que los científicos deseaban. Este hallazgo demostró que la calidad importaba mucho más que la cantidad; un número menor de guías perfectas conducía a resultados mucho más fiables.

Los investigadores también descubrieron que la disposición del genoma bacteriano requería una atención cuidadosa. Cuando intentaron eliminar un gen específico, notaron que el final de ese gen se solapaba con el principio de un gen vecino en la cadena opuesta. Si eliminaban el gen objetivo completo tal como tenían planeado originalmente, dañarían accidentalmente al vecino, haciendo imposible determinar si los efectos observados se debían a la pérdida del gen objetivo o al del vecino. Para solucionar esto, rediseñaron sus guías genéticas para dejar intacta esa pequeña sección de solapamiento. Esto permitió eliminar el gen objetivo preservando la integridad del gen adyacente. Este ajuste resaltó una lección crucial: la edición genética exitosa requiere una comprensión profunda de la arquitectura específica del genoma del organismo, no solo una aplicación genérica de un protocolo.

Finalmente, el equipo confirmó que su método optimizado funcionaba de forma generalizada. Aplicaron su flujo de trabajo refinado para eliminar cuatro genes adicionales, incluidos aquellos implicados en la resistencia de la bacteria a los antibióticos. En todos los casos, la combinación de la selección de antibióticos correcta, el uso de guías genéticas más largas y purificadas, y el diseño cuidadoso de los límites de la deleción, les permitió generar los mutantes deseados. También desarrollaron un conjunto de pruebas específicas para verificar que las ediciones fueran correctas, asegurando que las bacterias no hubieran integrado accidentalmente el nuevo ADN en el lugar equivido o solo parcialmente. Al establecer este marco robusto y adaptable, los investigadores han proporcionado a la comunidad científica una forma fiable de manipular los genes de este difícil patógeno. Este avance abre la puerta a investigaciones más profundas sobre cómo M. abscessus causa enfermedades y resiste el tratamiento, ofreciendo un camino más claro hacia el desarrollo de nuevas estrategias para combatir estas persistentes infecciones.