Application of the ORBIT Protocol for Targeted Gene Deletion to Mycobacterium abscessus

Bacteriën zijn meesters in overleving; ze evolueren voortdurend om weerstand te bieden aan de medicijnen die ontworpen zijn om hen te doden. Onder de meest formidabele hiervan behoren de mycobacteriën, een familie van taai, met was bedekte microben die onder andere de organisme bevat die verantwoordelijk is voor tuberculose. Een nauwe verwant, Mycobacterium abscessus, is een bijzonder gevaarlijke vijand geworden; het veroorzaakt ernstige long- en huidinfecties die berucht moeilijk te behandelen zijn. Deze bacterie bezit een natuurlijke, ingebouwde resistentie tegen veel antibiotica, waardoor standaardtherapieën vaak ineffectief zijn. Om te begrijpen hoe dit pathogeen overleeft en om nieuwe manieren te vinden om het te stoppen, moeten wetenschappers zijn genen bestuderen. Ze moeten in staat zijn om specifieke genen één voor één uit te schakelen om te zien wat er met de bacteriën gebeurt wanneer die genetische instructie ontbreekt. Het uitvoeren hiervan bij M. abscessus is echter als het proberen te bewerken van een document in een taal die je niet volledig spreekt; de instrumenten die perfect werken op andere bacteriën falen hier vaak, waardoor onderzoekers niet in staat zijn de precieze resultaten te verkrijgen die ze nodig hebben.

Een team van onderzoekers aan de Rutgers Health heeft nu een krachtig genetisch hulpmiddel genaamd ORBIT verfijnd om betrouwbaar te werken met Mycobacterium abscessus. Het ORBIT-systeem werkt als een moleculaire scalpel, waardoor wetenschappers specifieke secties van het bacteriële genoom met hoge precisie kunnen verwijderen. Het proces bestaat uit twee hoofdfasen: eerst wordt een helper-plasmide geïntroduceerd in de bacteriën om de interne machinerie te leveren die nodig is om nieuw genetisch materiaal te accepteren. Dit plasmide codeert voor de specifieke enzymen, de Che9c fage RecT annealase en de Bxb1 fage integrase, die het bewerkingsproces faciliteren. Ten tweede wordt een op maat gemaakte stukje genetische code, bekend als een oligonucleotide, geleverd samen met een "payload"-plasmide. Deze oligonucleotide is ontworpen om overeen te komen met het DNA rondom het doelgen, waarbij de bacteriële machinerie wordt gestuurd om het ongewenste gen te vervangen door de payload, die een marker draagt om succesvolle bewerkingen te identificeren. Hoewel dit systeem succesvol is gebruikt op andere mycobacteriën, merkten de onderzoekers dat het simpelweg toepassen van de bestaande instructies op M. abscessus niet werkte. De bacteriën waren te resistent tegen de standaard selectiemarkers en de genetische gidsen waren niet nauwkeurig genoeg om zuivere resultaten te leveren.

De onderzoekers begonnen door het probleem van de selectie aan te pakken. In hun eerste pogingen om een specifelijk gen te verwijderen, gebruikten ze een marker die de bacteriën resistent maakte tegen een antibioticum genaamd hygromycine. Ze verwachtten dat alleen de bacteriën met de succesvolle genverwijdering zouden overleven wanneer ze op een plaat met dit medicijn werden geplaatst. In plaats daarvan groeide de gehele populatie bacteriën, ongeacht of ze bewerkt waren of niet. Dit gebeurde omdat M. abscessus van nature resistent is tegen hygromycine, waardoor het selectieproces nutteloos werd. Het team realiseerde zich dat ze een ander antibioticum moesten vinden waar de bacteriën niet van nature resistent tegen zijn. Ze stapten over op een middel genaamd zeocine. Wanneer ze een payload-plasmide gebruikten met een zeocine-resistentiemarker, veranderden de resultaten drastisch. Alleen de bacteriën die de nieuwe genetische informatie succesvol hadden opgenomen, overleefden, waardoor de onderzoekers in staat waren de juiste mutanten te isoleren en te bestuderen.

Vervolgens richtte het team zich op de kwaliteit van de genetische gidsen zelf. De ORBIT-methode vertrouwt op lange strengen synthetisch DNA, genaamd oligonucleotiden, om de genverwijdering te leiden. De onderzoekers testten twee versies: een kortere streng en een langere streng. In theorie zouden langere strengen beter moeten werken omdat ze het doel-DNA uitgebreider matchen, maar het chemische proces dat wordt gebruikt om deze te bouwen, resulteert vaak in een mengsel van perfecte strengen en gebroken, incomplete strengen. Hoe langer de streng, hoe groter de kans op deze fouten. Om dit op te lossen, gebruikten de onderzoekers een zuiveringstechniek genaamd PAGE om de gebroken strengen eruit te filteren en alleen de perfecte, volledige gidsen over te houden. Toen ze de resultaten vergeleken, produceerden de kortere, ongezuiverde gidsen veel bacteriële kolonies, maar slechts een klein deel van hen had de juiste genverwijdering. In contrast hiermee produceerden de langere, gezuiverde gidsen veel minder kolonies in totaal, maar maar liefst drie van de vier gescreende kolonies bevatten de exacte deletie die de wetenschappers wilden. Deze bevinding toonde aan dat kwaliteit veel belangrijker was dan kwantiteit; een kleiner aantal perfecte gidsen leidde tot veel betrouwbaardere resultaten.

De onderzoekers ontdekten ook dat de lay-out van het bacteriële genoom zorgvuldige aandacht vereiste. Toen ze probeerden een specifelijk gen te verwijderen, merkten ze op dat het einde van dat gen overlapte met het begin van een naburig gen op de tegenoverliggende streng. Als ze het volledige doelgen zoals oorspronkelijk gepland zouden verwijderen, zouden ze per ongeluk de buurman beschadigen, waardoor het onmogelijk zou worden om te bepalen of de waargenomen effecten te wijten waren aan het verlies van het doelgen of aan de buurman. Om dit op te lossen, ontwierpen ze de genetische gidsen opnieuw zodat dat kleine, overlappende gedeelte intact bleef. Dit stelde hen in staat om het doelgen te verwijderen terwijl de integriteit van het aangrenzende gen behouden bleef. Deze aanpassing benadrukte een cruciale les: succesvolle genetische bewerking vereist een diep begrip van de specifieke architectuur van het genoom van het organisme, en niet slechts een generieke toepassing van een protocol.

Ten slotte bevestigde het team dat hun geoptimaliseerde methode breed toepasbaar was. Ze pasten hun verfijnde workflow toe om vier aanvullende genen te verwijderen, inclusief die betrokken bij de resistentie van de bacteriën tegen antibiotica. In elk geval zorgde de combinatie van de juiste antibioticaselectie, het gebruik van langere, gezuiverde genetische gidsen en het zorgvuldige ontwerp van de deletiegrenzen ervoor dat ze de gewenste mutanten konden genereren. Ze ontwikkelden ook een reeks specifieke tests om te verifiëren dat de bewerkingen correct waren, om er zeker van te zijn dat de bacteriën het nieuwe DNA niet per ongeluk op de verkeerde plek hadden geïntegreerd of slechts gedeeltelijk hadden opgenomen. Door dit robuuste en aanpasbare kader vast te stellen, hebben de onderzoekers de wetenschappelijke gemeenschap een betrouwbare manier geboden om de genen van dit moeilijke pathogeen te manipuleren. Deze vooruitgang opent de deur naar diepere onderzoeken naar hoe M. abscessus ziekten veroorzaakt en behandelingen weerstaat, wat een duidelijk pad biedt naar de ontwikkeling van nieuwe strategieën om deze hardnekkige infecties te bestrijden.