Application of the ORBIT Protocol for Targeted Gene Deletion to Mycobacterium abscessus

Bakterien sind Meister des Überlebens und entwickeln sich ständig weiter, um den Medikamenten zu trotzen, die dazu bestimmt sind, sie zu töten. Zu den furchterregendsten unter ihnen gehören die Mykobakterien, eine Familie von zähen, wachsartigen Mikroben, zu der auch der Organismus gehört, der für Tuberkulose verantwortlich ist. Ein enger Verwandter, Mycobacterium abscessus, hat sich als besonders gefährlicher Gegner herausgestellt, der schwere Lungen- und Hautinfektionen verursacht, die notorisch schwer zu behandeln sind. Dieses Bakterium besitzt eine natürliche, eingebaute Resistenz gegen viele Antibiotika, was Standardtherapien oft unwirksam macht. Um zu verstehen, wie dieser Erreger überlebt und um neue Wege zu finden, ihn zu stoppen, müssen Wissenschaftler seine Gene untersuchen. Sie müssen in der Lage sein, spezifische Gene einzeln auszuschalten, um zu sehen, was mit den Bakterien passiert, wenn diese genetische Anweisung fehlt. Dies jedoch bei M. abscessus zu tun, ist wie der Versuch, ein Dokument in einer Sprache zu bearbeiten, die man nicht vollständig spricht; die Werkzeuge, die bei anderen Bakterien perfekt funktionieren, versagen hier oft und lassen die Forscher ohne die präzisen Ergebnisse, die sie benötigen.

Ein Forschungsteam an der Rutgers Health hat nun ein leistungsstarkes genetisches Werkzeug namens ORBIT verfeinert, um zuverlässig mit Mycobacterium abscessus zu arbeiten. Das ORBIT-System fungiert wie ein molekulares Skalpell und ermöglicht es Wissenschaftlern, spezifische Abschnitte des bakteriellen Genoms mit hoher Präzision zu löschen. Der Prozess umfasst zwei Hauptschritte: Zuerst wird ein Helfer-Plasmid in die Bakterien eingeführt, um die interne Maschinerie bereitzustellen, die für die Aufnahme neuen genetischen Materials erforderlich ist. Dieses Plasmid kodiert die spezifischen Enzyme, die Che9c-Phagen-RecT-Annealase und die Bxb1-Phagen-Integrase, die den Editierungsprozess erleichtern. Zweitens wird ein maßgeschneidertes Stück genetischer Code, bekannt als Oligonukleotid, zusammen mit einem „Payload“-Plasmid geliefert. Dieses Oligonukleotid ist so konzipiert, dass es der DNA um das Zielgen herum entspricht und die bakterielle Maschinerie leitet, um das unerwünschte Gen gegen den Payload auszutauschen, welcher einen Marker zur Identifizierung erfolgreicher Edits trägt. Obwohl dieses System bereits erfolgreich bei anderen Mykobakterien eingesetzt wurde, stellten die Forscher fest, dass die bloße Anwendung der bestehenden Anweisungen auf M. abscessus nicht funktionierte. Die Bakterien waren zu resistent gegen die Standard-Selektionsmarker, und die genetischen Leitstrukturen waren nicht präzise genug, um saubere Ergebnisse zu liefern.

Die Forscher begannen damit, das Problem der Selektion anzugehen. In ihren ersten Versuchen, ein spezifisches Gen zu löschen, verwendeten sie einen Marker, der die Bakterien resistent gegen ein Antibiotikum namens Hygromycin machte. Sie erwarteten, dass nur die Bakterien mit der erfolgreichen Gendeletion überleben würden, wenn sie auf einer Platte mit diesem Wirkstoff platziert würden. Stattdessen wuchs die gesamte Bakterienpopulation, unabhängig davon, ob sie editiert worden waren oder nicht. Dies geschah, weil M. abscessus von Natur aus resistent gegen Hygromycin ist, was den Selektionsprozess nutzlos macht. Das Team erkannte, dass sie ein anderes Antibiotikum finden mussten, gegen das die Bakterien nicht von Natur aus resistent sind. Sie wechselten zu einem Wirkstoff namens Zeocin. Als sie ein Payload-Plasmid verwendeten, das einen Zeocin-Resistenzmarker trug, änderten sich die Ergebnisse dramatisch. Nur die Bakterien, die das neue genetische Material erfolgreich integriert hatten, überlebten, was es den Forschern ermöglichte, die korrekten Mutanten zu isolieren und zu untersuchen.

Als Nächstes konzentrierte sich das Team auf die Qualität der genetischen Leitstrukturen selbst. Die ORBIT-Methode beruht auf langen Strängen synthetischer DNA, sogenannten Oligonukleotiden, die die Gendeletion leiten. Die Forscher testeten zwei Versionen: einen kürzeren Strang und einen längeren. Theoretisch sollten längere Stränge besser funktionieren, da sie die Ziel-DNA umfassender abdecken, aber der chemische Prozess, der zum Aufbau dieser Stränge verwendet wird, führt oft zu einer Mischung aus perfekten Strängen und defekten, unvollständigen Strängen. Je länger der Strang ist, desto höher ist die Chance auf diese Fehler. Um dies zu lösen, setzten die Forscher eine Reinigungstechnik namens PAGE ein, um die defekten Stränge herauszufiltern und nur die perfekten, vollständigen Leitstrukturen beizubehalten. Als sie die Ergebnisse verglichen, produzierten die kürzeren, ungereinigten Leitstrukturen viele Bakterienkolonien, aber nur ein kleiner Bruchteil von ihnen wies die korrekte Gendeletion auf. Im Gegensatz dazu produzierten die längeren, gereinigten Leitstrukturen weit weniger Kolonien insgesamt, aber eine beeindruckende drei von vier untersuchten Kolonien enthielten genau die Deletion, die die Wissenschaftler wollten. Dieser Befund zeigte, dass Qualität weit wichtiger war als Quantität; eine kleinere Anzahl perfekter Leitstrukturen führte zu wesentlich zuverlässigeren Ergebnissen.

Die Forscher entdeckten auch, dass die Anordnung des bakteriellen Genoms sorgfältige Aufmerksamkeit erforderte. Als sie versuchten, ein spezifisches Gen zu löschen, bemerkten sie, dass das Ende dieses Gens mit dem Anfang eines benachbarten Gens auf dem gegenüberliegenden Strang überlappte. Wenn sie das gesamte Zielgen wie ursprünglich geplant gelöscht hätten, hätten sie versehentlich den Nachbarn beschädigt, was es unmöglich gemacht hätte, zu unterscheiden, ob die beobachteten Effekte auf den Verlust des Zielgens oder des Nachbarn zurückzuführen waren. Um dies zu beheben, gestalteten sie ihre genetischen Leitstrukturen so um, dass dieser kleine, überlappende Abschnitt intakt blieb. Dies ermöglichte es ihnen, das Zielgen zu entfernen und gleichzeitig die Integrität des benachbarten Gens zu bewahren. Diese Anpassung verdeutlichte eine entscheidende Lektion: Erfolgreiche genetische Editierung erfordert ein tiefes Verständnis der spezifischen Architektur des Genoms eines Organismus und nicht nur die generische Anwendung eines Protokolls.

Schließlich bestätigte das Team, dass ihre optimierte Methode universell funktioniert. Sie wandten ihren verfeinerten Arbeitsablauf an, um vier zusätzliche Gene zu löschen, darunter solche, die an der Resistenz der Bakterien gegen Antibiotika beteiligt sind. In jedem Fall ermöglichte die Kombination aus der korrekten Antibiotika-Selektion, der Verwendung längerer, gereinigter genetischer Leitstrukturen und der sorgfältigen Gestaltung der Deletionsgrenzen die Erzeugung der gewünschten Mutanten. Sie entwickelten auch eine Reihe spezifischer Tests, um die Korrektheit der Edits zu verifizieren und sicherzustellen, dass die Bakterien die neue DNA nicht versehentlich an der falschen Stelle integriert oder nur teilweise eingebaut hatten. Durch die Etablierung dieses robusten und anpassungsfähigen Rahmens haben die Forscher der wissenschaftlichen Gemeinschaft eine zuverlässige Möglichkeit zur Manipulation der Gene dieses schwierigen Erregers zur Verfügung gestellt. Dieser Fortschritt öffnet die Tür zu tiefergehenden Untersuchungen darüber, wie M. abscessus Krankheiten verursacht und Behandlungen widersteht, und bietet einen klareren Weg zur Entwicklung neuer Strategien zur Bekämpfung dieser hartnäckigen Infektionen.