Application of the ORBIT Protocol for Targeted Gene Deletion to Mycobacterium abscessus

बैक्टीरिया जीवित रहने के माहिर होते हैं, वे उन्हें मारने के लिए बनाई गई दवाओं का सामना करने के लिए लगातार विकसित होते रहते हैं। इनमें सबसे दुर्जेय जीवों में से एक माइकोबैक्टीरिया (mycobacteria) है, जो एक कठोर, मोमी परत वाले सूक्ष्मजीवों का परिवार है जिसमें तपेदिक (तपेदिक/टीबी) के लिए जिम्मेदार जीव भी शामिल है। एक करीबी रिश्तेदार, माइकोबैक्टेरियम एब्सेससस (Mycobacterium abscessus), एक विशेष रूप से खतरनाक दुश्मन के रूप में उभरा है, जो गंभीर फेफड़ों और त्वचा के संक्रमण का कारण बनता है जो इलाज के लिए अत्यंत कठिन होते हैं। यह बैक्टीरिया कई एंटीबायोटिक दवाओं के प्रति एक स्वाभाविक, अंतर्निहित प्रतिरोध रखता है, जिससे मानक उपचार अक्सर अप्रभावी हो जाते हैं। इस रोगजनक के जीवित रहने के तरीके को समझने और इसे रोकने के नए तरीके खोजने के लिए, वैज्ञानिकों को इसके जीन का अध्ययन करने की आवश्यकता है। उन्हें विशिष्ट जीन को एक-एक करके बंद करने में सक्षम होना चाहिए, ताकि यह देखा जा सके कि उस आनुवंशिक निर्देश के गायब होने पर बैक्टीरिया के साथ क्या होता है। हालांकि, M. एब्सेसस में ऐसा करना उस दस्तावेज़ को संपादित करने की कोशिश करने जैसा है जिसे आप पूरी तरह से नहीं जानते हैं; जो उपकरण अन्य बैक्टीरिया पर पूरी तरह से काम करते हैं वे यहाँ विफल हो जाते हैं, जिससे शोधकर्ता आवश्यक सटीक परिणाम प्राप्त करने में असमर्थ रह जाते हैं।

रटगर्स हेल्थ (Rutgers Health) के शोधकर्ताओं की एक टीम ने अब ORBIT नामक एक शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरण को माइकोबैक्टेरियम एब्सेसस के साथ विश्वसनीय रूप से काम करने के लिए परिष्कृत किया है। ORBIT प्रणाली एक आणविक स्कैल्पल (molecular scalpel) की तरह कार्य करती है, जो वैज्ञानिकों को उच्च सटीकता के साथ बैक्टीरिया के विशिष्ट खंडों को हटाने की अनुमति देती है। इस प्रक्रिया में दो मुख्य चरण शामिल हैं: पहले, बैक्टीरिया में एक सहायक प्लास्मिड (helper plasmid) पेश किया जाता है ताकि नया आनुवंशिक पदार्थ स्वीकार करने के लिए आवश्यक आंतरिक मशीनरी प्रदान की जा सके। यह प्लास्मिड विशिष्ट एंजाइमों, Che9c फेज RecT एनेलेस (annealase) और Bxb1 फेज इंटीग्रेज (integrase) को एनकोड करता है, जो संपादन प्रक्रिया को सुगम बनाते हैं। दूसरा, एक कस्टम-मेड आनुवंशिक कोड, जिसे ओलिगोन्यूक्लियोटाइड (oligonucleotide) कहा जाता है, को एक "पेलोड" प्लास्मिड के साथ वितरित किया जाता है। यह ओलिगोन्यूक्लियोटाइड लक्षित जीन के आसपास के डीएनए से मेल खाने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो बैक्टीरिया की मशीनरी को अवांछित जीन को पेलोड के साथ बदलने के लिए निर्देशित करता है, जिसमें सफल संपादन की पहचान करने के लिए एक मार्कर होता है। हालांकि इस प्रणाली का उपयोग अन्य माइकोबैक्टीरिया पर सफलतापूर्वक किया गया था, शोधकर्ताओं ने पाया कि केवल मौजूदा निर्देशों को M. एब्सेसस पर लागू करने से काम नहीं बना। बैक्टीरिया मानक चयन मार्करों के प्रति बहुत प्रतिरोधी थे, और आनुवंशिक मार्गदर्शक (genetic guides) सटीक परिणाम देने के लिए पर्याप्त सटीक नहीं थे।

शोधकर्ताओं ने शुरुआत में चयन (selection) की समस्या को हल करने से शुरू किया। अपने प्रारंभिक प्रयासों में एक विशिष्ट जीन को हटाने के लिए, उन्होंने एक ऐसा मार्कर इस्तेमाल किया जिसने बैक्टीरिया को हाइग्रोमाइसिन (hygromycin) नामक एंटीबायोटिक के प्रति प्रतिरोधी बनाया। उन्हें उम्मीद थी कि हाइग्रोमाइसिन युक्त प्लेट पर रखने पर केवल वही बैक्टीरिया जीवित रहेंगे जिनमें सफल जीन विलोपन (deletion) हुआ है। इसके बजाय, पूरे बैक्टीरिया की आबादी बढ़ गई, चाहे वे संपादित हुए हों या नहीं। ऐसा इसलिए हुआ क्योंकि M. एब्सेसस स्वाभाविक रूप से हाइग्रोमाइसिन के प्रति प्रतिरोधी है, जिससे चयन प्रक्रिया बेकार हो गई। टीम को समझ आया कि उन्हें एक अलग एंटीबायोटिक ढूंढना होगा जिसके प्रति बैक्टीरिया स्वाभाविक रूप से प्रतिरोधी न हो। उन्होंने ज़ियोसिन (zeocin) नामक दवा का उपयोग किया। जब उन्होंने ज़ियोसिन-प्रतिरोध मार्कर वाला एक पेलोड प्लास्मिड उपयोग किया, तो परिणाम नाटकीय रूप से बदल गए। केवल वही बैक्टीरिया जीवित रहे जिन्होंने सफलतापूर्वक नया आनुवंशिक पदार्थ शामिल किया था, जिससे शोधकर्ताओं को सही म्यूटेंट को अलग करने और अध्ययन करने में मदद मिली।

इसके बाद, टीम ने स्वयं आनुवंशिक मार्गदर्शकों की गुणवत्ता पर ध्यान केंद्रित किया। ORBIT विधि सिंथेटिक डीएनए के लंबे स्ट्रैंड्स पर निर्भर करती है, जिन्हें ओलिगोन्यूक्लियोटाइड कहा जाता है, जो जीन विलोपन का मार्गदर्शन करते हैं। शोधकर्ताओं ने दो संस्करणों का परीक्षण किया: एक छोटा स्ट्रैंड और एक लंबा स्ट्रैंड। सिद्धांत में, लंबे स्ट्रैंड बेहतर काम करने चाहिए क्योंकि वे लक्षित डीएनए से अधिक व्यापक रूप से मेल खाते हैं, लेकिन उन्हें बनाने में उपयोग की जाने वाली रासायनिक प्रक्रिया अक्सर पूर्ण और अधूरे स्ट्रैंड्स के मिश्रण का परिणाम होती है। स्ट्रैंड जितना लंबा होगा, इन त्रुटियों की संभावना उतनी ही अधिक होगी। इसे हल करने के लिए, शोधकर्ताओं ने टूटे हुए स्ट्रैंड्स को छानने और केवल पूर्ण, पूर्ण-लंबाई वाले मार्गदर्शकों को रखने के लिए PAGE नामक शुद्धिकरण तकनीक का उपयोग किया। जब उन्होंने परिणामों की तुलना की, तो छोटे, बिना शुद्ध किए गए मार्गदर्शकों ने कई बैक्टीरियल कॉलोनियां बनाईं, लेकिन उनमें से केवल एक छोटा हिस्सा ही सही जीन विलोपन वाला था। इसके विपरीत, लंबे, शुद्ध किए गए मार्गदर्शकों ने कुल मिलाकर बहुत कम कॉलोनियां बनाईं, लेकिन जांचे गए हर चार में से तीन कॉलोनियों में ठीक वही जीन विलोपन था जिसे वैज्ञानिक चाहते थे। इस निष्कर्ष ने दिखाया कि मात्रा से कहीं अधिक गुणवत्ता महत्वपूर्ण थी; पूर्ण मार्गदर्शकों की कम संख्या ने कहीं अधिक विश्वसनीय परिणाम दिए।

शोधकर्ताओं ने यह भी खोजा कि बैक्टीरिया के जीनोम के लेआउट (layout) पर सावधानीपूर्वक ध्यान देने की आवश्यकता है। जब उन्होंने एक विशिष्ट जीन को हटाने का प्रयास किया, तो उन्होंने देखा कि उस जीन का अंत दूसरे पड़ोसी जीन के प्रारंभ के साथ ओवरलैप (overlap) हो रहा है। यदि वे मूल योजना के अनुसार पूरे लक्षित जीन को हटा देते, तो वे अनजाने में पड़ोसी को नुकसान पहुँचा देते, जिससे यह बताना असंभव हो जाता कि देखे गए प्रभाव लक्षित जीन के नुकसान के कारण थे या पड़ोसी के। इसे ठीक करने के लिए, उन्होंने अपने आनुवंशिक मार्गदर्शकों को उस छोटे, ओवरलैपिंग हिस्से को बरकरार रखते हुए पुन: डिज़ाइन किया। इसने लक्षित जीन को हटाते हुए पड़ोसी जीन की अखंडता को सुरक्षित रखने की अनुमति दी। इस समायोजन ने एक महत्वपूर्ण सबक सिखाया: सफल आनुवंशिक संपादन के लिए जीव के विशिष्ट जीनोम संरचना की गहरी समझ की आवश्यकता होती है, न कि केवल एक सामान्य प्रोटोकॉल के अनुप्रयोग की।

अंत में, टीम ने पुष्टि की कि उनकी अनुकूलित विधि सभी मामलों में काम करती है। उन्होंने अपने परिष्कृत वर्कफ़्लो को चार अतिरिक्त जीन को हटाने के लिए लागू किया, जिनमें एंटीबायोटिक दवाओं के प्रति प्रतिरोध से जुड़े जीन भी शामिल थे। हर मामले में, सही एंटीबायोटिक चयन, लंबे, शुद्ध किए गए आनुवंशिक मार्गदर्शकों के उपयोग और विलोपन सीमाओं के सावधानीपूर्वक डिज़ाइन के संयोजन ने उन्हें वांछित म्यूटेंट उत्पन्न करने की अनुमति दी। उन्होंने यह सत्यापित करने के लिए परीक्षणों का एक सेट भी विकसित किया कि संपादन सही थे, जिससे यह सुनिश्चित हुआ कि बैक्टीरिया ने गलती से नए डीएनए को गलत जगह पर एकीकृत नहीं किया है या केवल आंशिक रूप से एकीकृत नहीं किया है। इस मजबूत और अनुकूलन योग्य ढांचे को स्थापित करके, शोधकर्ताओं ने वैज्ञानिक समुदाय को इस कठिन रोगजनक के जीन को नियंत्रित करने का एक विश्वसनीय तरीका प्रदान किया है। यह प्रगति M. एब्सेसस के रोग फैलाने और उपचार के प्रति प्रतिरोध करने के तरीकों की गहरी जांच के द्वार खोलती है, जो इन निरंतर संक्रमणों से निपटने के लिए नई रणनीतियों विकसित करने की दिशा में एक स्पष्ट मार्ग प्रदान करती है।