Application of the ORBIT Protocol for Targeted Gene Deletion to Mycobacterium abscessus

細菌は生存の達人であり、自らを殺そうとする薬に耐えるために絶えず進化しています。これらの中でも特に手強いものの一つがマイコバクテリウム属であり、結核の原因菌を含む、厚いワックス状の被膜を持つ微生物のグループです。その近縁種であるMycobacterium abscessusは、特に危険な敵として浮上しており、治療が極めて困難な重度の肺および皮膚感染症を引き起こします。この細菌は多くの抗生物質に対して天然の組み込み耐性を持っており、標準的な療法では効果がないことがよくあります。この病原体がどのように生き残り、それを阻止する新しい方法を見つけるためには、科学者はその遺伝子を研究する必要があります。彼らは特定の遺伝子を一つずつオフにして、その遺伝的指示が欠落したときに細菌に何が起こるのかを確認できなければなりません。しかし、M. abscessusにおいてこれを行うことは、自分が完全には理解していない言語で文書を編集しようとするようなものです。他の細菌には完璧に機能するツールも、ここでは失敗することが多く、研究者が求める精密な結果を得ることを妨げてしまいます。

ラトガース・ヘルス（Rutgers Health）の研究チームは、ORBITと呼ばれる強力な遺伝子ツールを、Mycobacterium abscessusでも確実に機能するように改良しました。ORBITシステムは分子レベルのメスのように機能し、科学者が細菌のゲノムの特定のセクションを高精度に削除することを可能にします。このプロセスは主に2つのステップで構成されています。まず、新しい遺伝物質を受け入れるために必要な内部機構を細菌に提供するために、ヘルパープラスミドを導入します。このプラスミドは、編集プロセスを促進する特定の酵素であるChe9cファージのRecTアニラーゼとBxb1ファージのインテグラーゼをコードしています。次に、ペイロードプラスミドと共に、「オリゴヌクレオチド」として知られるカスタムメイドの遺伝コードの断片が届けられます。このオリゴヌクレオチドは標的遺伝子の周囲のDNAに一致するように設計されており、不要な遺伝子をペイロード（成功した編集を識別するためのマーカーを運ぶもの）と入れ替えるよう細菌の機構を誘導します。このシステムは他のマイコバクテリウム属では成功していましたが、研究者たちは既存の指示をそのままM. abscessusに適用しても機能しないことを見出しました。この細菌は標準的な選択マーカーに対して耐性が強すぎ、遺伝的ガイドの精度も不十分であったため、きれいな結果が得られなかったのです。

研究者たちはまず、選択の問題に取り組むことから始めました。特定の遺伝子を削除しようとする初期の試みにおいて、彼らは細菌をハイグロマイシンという抗生物質に対して耐性を持たせるマーカーを使用しました。彼らは、編集に成功した細菌だけが、その薬を含むプレート上で生存すると予想していました。ところが、編集されたかどうかにかかわらず、細菌の集団全体が増殖してしまったのです。これは、M. abscessusが天然でハイグロマイシンに耐性を持っているため、選択プロセスが無意味になっていたことが原因でした。チームは、細菌が自力で耐性を持ち得ない別の抗生物質を見つける必要があると気づきました。彼らはゼオシンと呼ばれる薬に切り替えました。ゼオシン耐性マーカーを持つペイロードプラスミドを使用したところ、結果は劇的に変化しました。新しい遺伝物質を正常に取り込んだ細菌だけが生存し、これにより研究者は正しい変異体を分離して研究することが可能になりました。

次に、チームは遺伝的ガイド自体の品質に焦点を当てました。ORBIT法は、遺伝子欠失を導くための「オリゴヌクレオチド」と呼ばれる長い合成DNA鎖に依存しています。研究者は、短い鎖と長い鎖の2つのバージョンをテストしました。理論的には、長い鎖の方が標的DNAにより広く一致するため、よりうまく機能するはずですが、それらを構築するために使用される化学プロセスによって、完璧な鎖と壊れた不完全な鎖の混合物が生じることがよくあります。鎖が長ければ長いほど、これらのエラーが発生する可能性が高まります。これを解決するために、研究者はPAGEと呼ばれる精製技術を使用して、壊れた鎖を濾過し、完璧で完全な長さのガイドのみを残しました。比較した結果、短くて未精製のガイドは多くの細菌コロニーを生成しましたが、そのうちのわずかな割合しか正しい遺伝子欠失を含んでいませんでした。対照的に、長く精製されたガイドは、生成されるコロニーの総数ははるかに少なかったものの、スクリーニングされたコロニーの4つに3つという驚異的な割合で、科学者が望んだ通りの正確な欠失が含まれていました。この発見は、量よりも質がはるかに重要であることを示しました。つまり、より少ない数の完璧なガイドの方が、はるかに信頼性の高い結果をもたらすということです。

研究者たちはまた、細菌ゲノムのレイアウトにも注意が必要であることを発見しました。特定の遺伝子を削除しようとした際、その遺伝子の末端が反対側のストランドにある隣接する遺伝子の始まり部分と重なっていることに気づきました。もし当初の計画通りに遺伝子全体を削除してしまうと、隣の遺伝子を誤って損傷させてしまい、観察された影響が標的遺伝子の消失によるものなのか、それとも隣の遺伝子の影響なのかを判断できなくなります。これを修正するために、彼らは重なっている小さなセクションをそのまま残すように遺伝的ガイドを再設計しました。これにより、隣接する遺伝子の完全性を保ちつつ、標的遺伝子を除去することができました。この調整は、成功する遺伝子編集には、単なる一般的なプロトコルの適用ではなく、その生物のゲノム特有の構造に関する深い理解が必要であるという重要な教訓を浮き彫りにしました。

最後に、チームは最適化された手法が全体として機能することを確認しました。彼らは洗練されたワークフローを、抗生物質への耐性に関与するものを含む4つの追加の遺伝子の削除に適用しました。どのケースにおいても、正しい抗生物質選択、長く精製された遺伝的ガイドの使用、そして慎重に設計された欠失境界の組み合わせにより、目的の変異体を生成することができました。彼らはまた、エディットが正しかったことを検証するための一連の特定のテストも開発し、DNAが間違った場所に組み込まれたり、部分的にしか組み込まれていなかったりしないことを確認しました。この堅牢で適応性の高い枠組みを確立することで、研究者たちはこの困難な病原体の遺伝子を操作するための信頼できる方法を科学界に提供しました。この進展は、M. abscessusがどのように病気を引き起こし、治療に抵抗するかについてのより深い調査への扉を開き、この執拗な感染症に対抗するための新しい戦略の開発に向けた明確な道筋を示しています。