Development of an Agnostic Clinical Metagenomic Workflow for Respiratory RNA Viruses

عندما يدخل شخص إلى العيادة وهو يعاني من سعال أو حمى، يحتاج الأطباء إلى معرفة المسبب للمرض بسرعة. لعقود من الزمن، كانت الطريقة القياسية لتحديد الجاني هي البحث عن مشتبه بهم محددين. فإذا كان المريض يعاني من أعراض تشبه الإنفلونزا، فقد يجري المختبر اختباراً مصمماً لاصطياد فيروس الإنفلونزا. وإذا جاءت نتيجة الاختبار سلبية، فقد يجرون اختباراً آخر لفيروس مختلف. هذا النهج يعمل جيداً عندما تكون قائمة الأسباب المحتملة قصيرة ومعروفة، ومع ذلك، فإنه يواجه صعوبة عندما يظهر فيروس جديد مجهول، أو عندما يكون المريض مصاباً بمزيء من المسببات المرضية التي لم يُصمم أي اختبار منفرد للعثور عليها.

ولحل هذه المشكلة، طور العلماء طريقة تسمى "الميتاجينوميات السريرية" (clinical metagenomics). فبدلاً من البحث عن فيروس محدد، تقوم هذه الطريقة بأخذ عينة من المريض، مثل مسحة من الأنف أو الحلق، وقراءة كل قطعة جينية موجودة فيها. الأمر يشبه قراءة كل كتاب في مكتبة للعثور على قصة معينة، بدلاً من مجرد التحقق من الفهرس. والهدف هو تحديد أي فيروس، سواء كان معروفاً أو مجهولاً، دون الحاجة لمعرفة ماهيته مسبقاً. هذه فكرة قوية للاستعداد للجوائح، لكنها تواجه عقبة عملية هائلة؛ فالمسحة من أنف الإنسان مليئة في الغالب بخلايا وبكتيريا بشرية، بينما تكون جزيئات الفيروسات الفعلية نادرة غالباً، ومختبئة بين مليارات القطع الجينية الأخرى. ولجعل الفيروس مرئياً، يجب على العلماء أولاً تنظيف العينة لإزالة الضجيج الخلفي، ثم تضخيم الكمية الضئيلة من المادة الجينية للفيروس حتى تصبح عالية بما يكفي لتسمعها أجهزة التسلسل الجيني.

وضع فريق من الباحثين في جامعة أكسفورد ومستشفيات جامعة أكسفورد خطة لبناء سير عمل موثوق لهذه المهمة، وتحديداً للفيروسات ذات الحمض النووي الريبوزي (RNA) التي تصيب الجهاز التنفسي. وهذه هي الفيروسات التي تسبب نزلات البرد الشائعة، والإنفلونزا، وغيرها من الأمراض التنفسية الأكثر خطورة. عمل الباحثون على عينات متبقية من مرضى تم اختبارهم بالفعل لعدوى روتينية. وكان تحديهم يتمثل في إنشاء عملية خطوة بخطوة لإغناء الفيروس، وإزالة الفوضى البشرية والبكتيرية، ثم نسخ الشفرة الجينية للفيروس لمرات كافية ليتم اكتشافها بواسطة جهاز التسلسل، وكل ذلك دون الانحياز لنوع واحد من الفيروسات.

بدأ الفريق باختبار طرق مختلفة لفصل الفيروس عن بقية العينة. جربوا تدوير السائل بسرعات مختلفة لفصل الخلايا الثقيلة عن جزيئات الفيروس الأخف. كما اختبروا طرقاً لكسر أغلفة الفيروسات القوية وإنزيمات لهضم المادة الجينية الحرة التي ليست جزءاً من فيروس. وكان جزء حاسم من عملهم يتضمن مقارنة طريقتين مختلفتين لنسخ المادة الجينية بمجرد استخراجها. استخدمت إحدى الطريقتين تقنية تسمى "تضخيم التضاعف المتعدد" (multiple displacement amplification)، والتي تعتمد على نوع معين من الإنزيمات لنسخ السلاسل الجينية الدائرية. أما الطريقة الأخرى، المعروفة باسم "التضخيم أحادي البادئ المستقل عن التسلسل" (sequence-independent single primer amplification)، فقد استخدمت استراتيجية مختلفة لنسخ المادة الجينية بشكل خطي.

بعد إجراء اختبارات مكثفة، وجد الباحثون أن طريقة النسخ الخطي أنتجت باستمرار نتائج أفضل؛ حيث اكتشفت فيروسات أكثر وولدت بيانات جينية أكثر من الطريقة الدائرية. ثم قاموا بتنقيح عملية التنظيف، واكتشفوا أن مجرد تدوير العينة لإزالة الخلايا الكبيرة ليس كافياً. كانت أفضل النتائج تأتي من نهج متعدد الخطوات: أولاً، تدوير العينة بسرعة متوسطة لإزالة الخلايا البشرية الكبيرة والحطام؛ ثانياً، معالجة السائل المتبقي بإنزيم يلتهم المادة الجينية الحرة من البكتيريا والبشر، تاركاً جزيئات الفيروس المحمية خلفه؛ وثالثاً، استخدام طريقة الترسيب الكيميائي لجمع جزيئات الفيروس السليمة في كتلة متماسكة (pellet). ثم تمت معالجة هذه الكتلة لاستخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA).

اختبر الباحثون سير العمل الأمثل هذا على عشرات العينات السريرية التي كانت تحتوي على فيروسات تنفسية متنوعة. نجحوا في اكتشاف مجموعة واسعة من المسببات المرضية، بما في ذلك فيروسات كورونا، وفيروسات الإنفلونزا، والفيروس المخلوي التنفسي، وعدة أنواع من الفيروسات الأنفية والمعوية. عملت العملية بشكل جيد مع الفيروسات التي تمتلك غطاءً خارجياً دهنيًا، لكن ظل اكتشاف الفيروسات غير المغلفة، التي تمتلك غلافاً بروتينياً أكثر صلابة، أمراً أكثر صعوبة. ورغم هذه التحديات، تمكن الفريق من اكتشاف هذه الفيروسات الصعبة في عدة عينات، مما أظهر أن الطريقة كانت قوية بما يكفي للتعامل مع أنواع مختلفة من التهديدات التنفسية.

طوال فترة التطوير، استخدم الفريق مواد ضابطة لضمان عمل عمليتهم بشكل صحيح. فقد أضافوا كميات معروفة من فيروسات غير ضارة إلى العينات لتعمل كنقاط تفتيش. أحد الضوابط كان "العاثية" (bacteriophage)، وهو فيروس يصيب البكتيريا، والذي ساعدهم في تتبع عملية الاستخراج. واستخدمت ضوابط أخرى للتحقق من خطوات النسخ والتسلسل. ووجدوا أنه من خلال ضبط تركيز هذه الضوابط وتكرار خطوات التنظيف، يمكنهم اكتشاف وجود هذه العلامات بشكل موثوق، مما منحهم الثقة في أن النظام حساس بما يكفي للعثور على فيروسات المرضى الحقيقية.

تجمع سير العمل النهائي الذي طوروه هذه الخطوات في عملية متماسكة. تبدأ بتوضيح العينة لإزالة الحطام الكبير، يليه علاج إنزيمي لتنظيف الضجيج الجيني الخلفي. ثم يتم تركيز جزيئات الفيروس المتبقية في كتلة، ومنها يتم استخراج الحمض النووي الريبوزي (RNA). بعد ذلك، يتم تحويل هذا الحمض النووي إلى شكل يمكن نسخه ثم تسلسله باستخدام منصة تسلسل محمولة وعالية السرعة. وأشار الباحثون إلى أنه على الرغم من أن هذه الطريقة فعالة للغاية، إلا أنها ليست مثالية بعد؛ فهي تواجه أحياناً صعوبة في اكتشاف الفيروسات الموجودة بأعداد ضئيلة جداً أو تلك ذات الأغلفة شديدة الصلابة. ومع ذلك، فإن القدرة على اكتشاف طيف واسع من الفيروسات دون الحاجة لمعرفة ما نبحث عنه مسبقاً تمثل خطوة كبيرة للأمام.

تخلص الدراسة إلى أن هذا النهج "غير المتحيز" (agnostic approach) هو مسار قابل للتطبيق للتشخيص المستقبلي. فهو يوفر وسيلة لتحديد ليس فقط "المشتبه بهم المعتادين"، بل أيضاً التهديدات الفيروسية الناشئة أو غير المتوقعة. يخطط الباحثون لاختبار سير العمل هذا مقابل الاختبارات التجارية القياسية لمعرفة كيفية أدائه في البيئات السريرية الواقعية. ومن خلال إثبات قدرتهم على بناء نظام يمكنه الاستماع إلى المحادثة الجينية الكاملة في العينة، بدلاً من مجرد الصراخ باسم واحد محدد، فقد وضعوا حجر الأساس لطريقة أكثر شمولاً لمراقبة العدوى التنفسية والاستجابة لها. ويشير هذا العمل إلى أنه في المستقبل، قد يتمكن الأطباء من استخدام اختبار واحد لاستبعاد أو تأكيد مجموعة واسعة من المسببات الفيروسية، مما يوفر صورة أوضح لما يجعل المريض مريضاً.