Development of an Agnostic Clinical Metagenomic Workflow for Respiratory RNA Viruses

Quando uma pessoa entra em uma clínica com tosse ou febre, os médicos precisam saber rapidamente o que está causando a doença. Por décadas, a maneira padrão de encontrar o culpado tem sido procurar por suspeitos específicos. Se um paciente apresenta sintomas semelhantes aos da gripe, um laboratório pode realizar um teste projetado para capturar o vírus da influenza. Se o teste der negativo, eles podem realizar outro para um vírus diferente. Essa abordagem funciona bem quando a lista de causas possíveis é curta e bem conhecida. No entanto, ela tem dificuldades quando um novo vírus desconhecido aparece, ou quando um paciente está infectado com uma mistura de patógenos que nenhum teste individual foi projetado para encontrar.

Para resolver isso, cientistas desenvolveram um método chamado metagenômica clínica. Em vez de caçar um vírus específico, essa abordagem pega uma amostra de um paciente, como um swab do nariz ou da garganta, e lê cada pedaço de material genético presente nele. É como ler todos os livros de uma biblioteca para encontrar uma história específica, em vez de apenas verificar o catálogo. O objetivo é identificar qualquer vírus, conhecido ou desconhecido, sem precisar saber o que ele é antecipadamente. Este é um conceito poderoso para a preparação para pandemias, mas enfrenta um enorme obstáculo prático. Um swab do nariz humano é preenchido principalmente por células humanas e bactérias. As partículas virais reais são frequentemente raras, escondidas entre bilhões de outros fragmentos genéticos. Para tornar o vírus visível, os cientistas devem primeiro limpar a amostra para remover o ruído de fundo e então amplificar a pequena quantidade de material genético viral até que seja alto o suficiente para ser ouvido pelas máquinas de sequenciamento.

Uma equipe de pesquisadores da Universidade de Oxford e do Hospital Universitário de Oxford estabeleceu o objetivo de construir um fluxo de trabalho confiável para esta tarefa, especificamente para vírus de RNA que infectam o sistema respiratório. Estes são os vírus que causam o resfriado comum, a gripe e doenças respiratórias mais graves. Os pesquisadores trabalharam com amostras remanescentes de pacientes que já haviam sido testados para infecções rotineiras. O desafio deles era criar um processo passo a passo que pudesse enriquecer o vírus, remover a sujeira humana e bacteriana e, em seguida, copiar o código genético viral vezes o suficiente para ser detectado por uma máquina de sequenciamento, tudo isso sem enviesar os resultados para um único tipo de vírus.

A equipe começou testando várias maneiras de separar o vírus do restante da amostra. Eles tentaram girar o líquido em diferentes velocidades para separar células pesadas de partículas virais mais leves. Eles também testaram métodos para romper cascas virais resistentes e enzimas para digerir o material genético flutuante que não fazia parte de um vírus. Uma parte crítica do trabalho envolveu comparar duas maneiras diferentes de copiar o material genético uma vez que este fosse extraído. Um método utilizou uma técnica chamada amplificação por deslocamento múltiplo, que depende de um tipo específico de enzima para copiar fitas genéticas circularizadas. O outro método, conhecido como amplificação de primer único independente de sequência, utilizou uma estratégia diferente para copiar o material genético de forma linear.

Após realizar testes extensivos, os pesquisadores descobriram que o método de cópia linear produzia consistentemente melhores resultados. Ele detectava mais vírus e gerava mais dados genéticos do que o método circular. Eles então refinaram o processo de limpeza. Descobriram que simplesmente girar a amostra para remover grandes células não era suficiente. Os melhores resultados vieram de uma abordagem de múltiplas etapas: primeiro, girar a amostra em uma velocidade moderada para remover células humanas grandes e detritos; segundo, tratar o líquido restante com uma enzima que consome o material genético flutuante de bactérias e humanos, deixando as partículas virais protegidas para trás; e terceiro, usar um método de precipitação química para reunir as partículas virais intactas em um pellet denso. Este pellet foi então processado para extrair o RNA.

Os pesquisadores testaram esse fluxo de trabalho otimizado em dezenas de amostras clínicas que continham vários vírus respiratórios conhecidos. Eles detectaram com sucesso uma ampla gama de patógenos, incluindo coronavírus, vírus da influenza, vírus sincicial respiratório e vários tipos de rinovírus e enterovírus. O processo funcionou bem para vírus que possuem um revestimento externo gorduroso, mas permaneceu mais difícil detectar vírus não envelopados, que possuem uma casca proteica mais resistente. Mesmo com esses desafios, a equipe conseguiu detectar esses vírus mais difíceis de encontrar em várias amostras, mostrando que o método era robusto o suficiente para lidar com diferentes tipos de ameaças respiratórias.

Durante todo o desenvolvimento, a equipe utilizou materiais de controle para garantir que seu processo estivesse funcionando corretamente. Eles adicionaram quantidades conhecidas de vírus inofensivos às amostras para servirem como pontos de verificação. Um controle era um bacteriófago, um vírus que infecta bactérias, que ajudou a rastrear o processo de extração. Outros foram usados para verificar as etapas de cópia e sequenciamento. Eles descobriram que, ao ajustar a concentração desses controles e refinar seus passos de limpeza, podiam detectar de forma confiável a presença desses marcadores, dando-lhes confiança de que o sistema era sensível o suficiente para encontrar vírus reais de pacientes.

O fluxo de trabalho final que desenvolveram combina essas etapas em um processo coeso. Começa com o esclarecimento da amostra para remover detritos grandes, seguido por um tratamento enzimático para limpar o ruído genético de fundo. As partículas virais restantes são então concentradas em um pellet, do qual o RNA é extraído. Este RNA é convertido em uma forma que pode ser copiada e então sequenciada usando uma plataforma de sequenciamento portátil e de alta velocidade. Os pesquisadores observaram que, embora este método seja altamente eficaz, ele ainda não é perfeito. Às vezes, tem dificuldade em detectar vírus que estão presentes em números muito baixos ou aqueles com cascas particularmente resistentes. No entanto, a capacidade de detectar um amplo espectro de vírus sem precisar saber o que procurar antecipadamente representa um passo significativo à frente.

O estudo conclui que esta abordagem agnóstica é um caminho viável para diagnósticos futuros. Ela oferece uma maneira de identificar não apenas os suspeitos usuais, mas também ameaças virais emergentes ou inesperadas. Os pesquisadores planejam testar este fluxo de trabalho contra testes comerciais padrão para ver como ele se comporta em ambientes clínicos do mundo real. Ao provar que podem construir um sistema que escuta toda a conversa genética em uma amostra, em vez de apenas gritar por um nome específico, eles lançaram as bases para uma maneira mais abrangente de monitorar e responder a infecções respiratórias. Este trabalho sugere que, no futuro, os médicos poderão usar um único teste para excluir ou confirmar uma ampla gama de causas virais, proporcionando uma imagem mais clara do que está deixando o paciente doente.