Development of an Agnostic Clinical Metagenomic Workflow for Respiratory RNA Viruses

जब कोई व्यक्ति खांसी या बुखार के साथ क्लिनिक में आता है, तो डॉक्टरों को यह जल्दी से जानने की आवश्यकता होती है कि बीमारी का कारण क्या है। दशकों से, दोषी को खोजने का मानक तरीका विशिष्ट संदिग्धों की तलाश करना रहा है। यदि किसी रोगी में फ्लू जैसे लक्षण हैं, तो लैब इन्फ्लुएंजा वायरस को पकड़ने के लिए डिज़ाइन किए गए परीक्षण का उपयोग कर सकती है। यदि परीक्षण नकारात्मक आता है, तो वे किसी अन्य वायरस के लिए दूसरा परीक्षण कर सकते हैं। यह दृष्टिकोण तब अच्छा काम करता है जब संभावित कारणों की सूची छोटी और सुप्रसिद्ध हो। हालाँकि, जब कोई नया, अज्ञात वायरस प्रकट होता है, या जब एक रोगी ऐसे मिश्रण से संक्रमित होता है जिसे कोई भी एकल परीक्षण नहीं खोज सकता, तो यह संघर्ष करता है।

इसे हल करने के लिए, वैज्ञानिकों ने क्लिनिकल मेटाजीनोमिक्स नामक एक विधि विकसित की है। किसी विशिष्ट वायरस की तलाश करने के बजाय, यह दृष्टिकोण रोगी के नमूने (जैसे नाक या गले का स्वाब) को लेता है और उसमें मौजूद हर एक जेनेटिक मटेरियल (आनुवंशिक सामग्री) को पढ़ता है। यह किसी विशिष्ट कहानी को खोजने के लिए लाइब्रेरी में मौजूद हर किताब को पढ़ने जैसा है, बजाय इसके कि केवल कैटलॉग की जांच की जाए। इसका लक्ष्य किसी भी वायरस, चाहे वह ज्ञात हो या अज्ञात, को बिना यह जाने पहचानना है कि वह क्या है। यह महामारी की तैयारी के लिए एक शक्तिशाली विचार है, लेकिन इसके सामने एक बहुत बड़ी व्यावहारिक बाधा है। मानव नाक के स्वाब में ज्यादातर मानव कोशिकाएं और बैक्टीरिया होते हैं। वास्तविक वायरस कण अक्सर दुर्लभ होते हैं, जो अरबों अन्य जेनेटिक टुकड़ों के बीच छिपे होते हैं। वायरस को दृश्यमान बनाने के लिए, वैज्ञानिकों को पहले बैकग्राउंड के शोर (noise) को हटाने के लिए नमूने को साफ करना होगा और फिर वायरस की सूक्ष्म मात्रा को तब तक बढ़ाना (amplify) होगा जब तक कि वह सीक्वेंसिंग मशीनों द्वारा सुनी जा सकने वाली पर्याप्त आवाज न बन जाए।

ऑक्सफोर्ड विश्वविद्यालय और ऑक्सफोर्ड यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल्स के शोधकर्ताओं के एक दल ने इस कार्य के लिए एक विश्वसनीय वर्कफ़्लो बनाने का लक्ष्य रखा, विशेष रूप से श्वसन प्रणाली को संक्रमित करने वाले आरएनए (RNA) वायरसों के लिए। ये वे वायरस हैं जो सामान्य सर्दी, फ्लू और अधिक गंभीर श्वसन रोगों का कारण बनते हैं। शोधकर्ताओं ने उन रोगियों के बचे हुए नमूनों के साथ काम किया जिनका पहले ही नियमित संक्रमणों के लिए परीक्षण किया जा चुका था। उनकी चुनौती एक ऐसी चरण-दर-चरण प्रक्रिया बनाना था जो वायरस को समृद्ध (enrich) कर सके, मानवीय और बैक्टीरियल कचरे को हटा सके, और फिर वायरल जेनेटिक कोड की इतनी प्रतियां बना सके कि उसे सीक्वेंसिंग मशीन द्वारा पहचाना जा सके, और यह सब किसी एक प्रकार के वायरस की ओर झुकाव (bias) पैदा किए बिना हो सके।

टीम ने नमूने से वायरस को अलग करने के विभिन्न तरीकों का परीक्षण करने से शुरुआत की। उन्होंने भारी कोशिकाओं को हल्के वायरस कणों से अलग करने के लिए तरल को विभिन्न गति से घुमाकर (spinning) देखा। उन्होंने कठिन वायरस शैल (shells) को तोड़ने के विभिन्न तरीकों और मुक्त रूप से तैरते जेनेटिक मटेरियल को पचाने वाले एंजाइमों का भी परीक्षण किया। उनके काम का एक महत्वपूर्ण हिस्सा जेनेटिक मटेरियल को कॉपी करने के दो अलग-अलग तरीकों की तुलना करना था। एक विधि 'मल्टीपल डिस्प्लेसमेंट एम्प्लीफिकेशन' का उपयोग करती है, जो सर्कुलराइज्ड जेनेटिक स्ट्रैंड्स की नकल करने के लिए एक विशिष्ट प्रकार के एंजाइम पर निर्भर करती है। दूसरी विधि, जिसे 'सीक्वेंस-इंडिपेंडेंट सिंगल प्राइमर एम्प्लीफिकेशन' के रूप में जाना जाता है, जेनेटिक मटेरियल को लीनियर (रैखिक) रूप से कॉपी करने के लिए एक अलग रणनीति का उपयोग करती है।

विस्तृत परीक्षण चलाने के बाद, शोधकर्ताओं ने पाया कि लीनियर कॉपी करने वाली विधि ने लगातार बेहतर परिणाम दिए। इसने सर्कुलर विधि की तुलना में अधिक वायरस का पता लगाया और अधिक जेनेटिक डेटा उत्पन्न किया। इसके बाद उन्होंने सफाई की प्रक्रिया को परिष्कृत किया। उन्होंने पाया कि केवल बड़े सेल्स को हटाने के लिए नमूने को घुमाना पर्याप्त नहीं था। सबसे अच्छे परिणाम एक बहु-चरणीय दृष्टिकोण से मिले: पहले, बड़े मानव सेल्स और मलबे को हटाने के लिए नमूने को मध्यम गति से घुमाना; दूसरा, शेष तरल को एक ऐसे एंजाइम से उपचारित करना जो बैक्टीरिया और मनुष्यों के मुक्त रूप से तैरते जेनेटिक मटेरियल को खा जाता है, जिससे सुरक्षित वायरस कण पीछे रह जाते हैं; और तीसरा, एक केमिकल प्रेसिपिटेशन (अवक्षेपण) विधि का उपयोग करके बरकरार वायरस कणों को एक सघन पेलेट (pellet) में इकट्ठा करना। इस पेलेट को फिर आरएनए (RNA) निकालने के लिए प्रोसेस किया गया।

शोधकर्ताओं ने अपने अनुकूलित वर्कफ़्लो का परीक्षण दर्जनों क्लिनिकल नमूनों पर किया जिनमें विभिन्न श्वसन वायरस होने की पुष्टि थी। वे कोरोनाविरस, इन्फ्लुएंजा वायरस, रेस्पिरेटरी सिन्सिटियल वायरस, और कई प्रकार के राइनोवायरस और एंटरोवायरस सहित वायरसों की एक विस्तृत श्रृंखला का पता लगाने में सफल रहे। यह प्रक्रिया उन वायरसों के लिए अच्छी तरह से काम करती है जिनकी बाहरी परत वसायुक्त (fatty outer coating) होती है, लेकिन नॉन-एनवेलप्ड (non-enveloped) वायरसों का पता लगाना अधिक कठिन बना रहा, जिनकी बाहरी परत प्रोटीन की होती है। इन चुनौतियों के बावजूद, टीम ने कई नमूनों में इन कठिन वायरसों का पता लगाने में सफलता प्राप्त की, जो दर्शाता है कि यह विधि विभिन्न प्रकार के श्वसन खतरों को संभालने के लिए पर्याप्त मजबूत थी।

विकास के दौरान, टीम ने यह सुनिश्चित करने के लिए कि उनकी प्रक्रिया सही ढंग से काम कर रही है, कंट्रोल मटेरियल्स का उपयोग किया। उन्होंने नमूनों में ज्ञात मात्रा में हानिरहित वायरस मिलाए ताकि वे चेकपॉइंट के रूप में कार्य कर सकें। एक कंट्रोल 'बैक्टीरियोफेज' था, जो बैक्टीरिया को संक्रमित करने वाला वायरस है, जिसने उन्हें निष्कर्षण (extraction) प्रक्रिया को ट्रैक करने में मदद की। अन्य का उपयोग कॉपी और सीक्वेंसिंग चरणों की जांच के लिए किया गया। उन्होंने पाया कि इन कंट्रोल्स की सांद्रता (concentration) को समायोजित करके और अपनी सफाई प्रक्रियाओं को परिष्कृत करके, वे इन मार्करों की उपस्थिति का विश्वसनीय रूप से पता लगा सकते थे, जिससे उन्हें विश्वास हुआ कि सिस्टम वास्तविक रोगी वायरसों को खोजने के लिए पर्याप्त संवेदनशील है।

उनके द्वारा विकसित अंतिम वर्कफ़्लो इन चरणों को एक सुसंगत प्रक्रिया में जोड़ता है। यह बड़े मलबे को हटाने के लिए नमूने को स्पष्ट करने से शुरू होता है, जिसके बाद बैकग्राउंड जेनेटिक शोर को साफ करने के लिए एक एंजाइमेटिक उपचार किया जाता है। शेष वायरस कणों को एक पेलेट में केंद्रित किया जाता है, जिससे आरएनए निकाला जाता है। इस आरएनए को एक ऐसे रूप में बदला जाता है जिसे कॉपी किया जा सके और फिर एक पोर्टेबल, हाई-स्पीड सीक्वेंसिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग करके सीक्वेंस किया जा सके। शोधकर्ताओं ने नोट किया कि हालांकि यह विधि अत्यधिक प्रभावी है, लेकिन यह अभी पूर्ण नहीं है। यह कभी-कभी उन वायरसों का पता लगाने में संघर्ष करती है जो बहुत कम संख्या में मौजूद होते हैं या जिनकी बाहरी परत विशेष रूप से कठोर होती है। हालांकि, बिना यह जाने कि पहले से क्या खोजना है, वायरसों के एक विस्तृत स्पेक्ट्रम का पता लगाने की क्षमता एक महत्वपूर्ण प्रगति है।

अध्ययन निष्कर्ष निकालता है कि यह एगोस्टिक (agnostic) दृष्टिकोण भविष्य के डायग्नोस्टिक्स के लिए एक व्यवहार्य मार्ग है। यह न केवल सामान्य संदिग्धों को, बल्कि उभरते या अप्रत्याशित वायरल खतरों को भी पहचानने का एक तरीका प्रदान करता है। शोधकर्ता इस वर्कफ़्लो का मानक वाणिज्यिक परीक्षणों के विरुद्ध परीक्षण करने की योजना बना रहे हैं ताकि यह देखा जा सके कि वास्तविक नैदानिक सेटिंग्स में यह कैसा प्रदर्शन करता है। यह सिद्ध करके कि वे एक ऐसा सिस्टम बना सकते हैं जो केवल एक विशिष्ट नाम के लिए चिल्लाने के बजाय, नमूने में चल रही पूरी जेनेटिक बातचीत को सुन सकता है, उन्होंने श्वसन संक्रमण की अधिक व्यापक निगरानी और प्रतिक्रिया के लिए आधार तैयार किया है। यह कार्य सुझाव देता है कि भविष्य में, डॉक्टर एक ही परीक्षण का उपयोग करके वायरसों के एक विस्तृत समूह को खारिज या पुष्टि करने में सक्षम हो सकते हैं, जिससे यह स्पष्ट चित्र मिल सकेगा कि रोगी को वास्तव में क्या बीमार कर रहा है।