Development of an Agnostic Clinical Metagenomic Workflow for Respiratory RNA Viruses

Quando una persona entra in una clinica con la tosse o la febbre, i medici hanno bisogno di sapere rapidamente cosa sta causando l'illness. Per decenni, il modo standard per trovare il colpevole è stato quello di cercare sospetti specifici. Se un paziente presenta sintomi simil-influenzali, un laboratorio potrebbe eseguire un test progettato per catturare il virus dell'influenza. Se il test risulta negativo, potrebbero eseguire un altro test per un virus diverso. Questo approccio funziona bene quando l'elenco delle possibili cause è breve e ben noto. Tuttavia, fatica quando appare un virus nuovo e sconosciuto, o quando un paziente è infettato da un mix di patogeni che nessun singolo test è stato progettato per trovare.

Per risolvere questo problema, gli scienziati hanno sviluppato un metodo chiamato metagenomica clinica. Invece di dare la caccia a un singolo virus specifico, questo approccio preleva un campione da un paziente, come un tampone dal naso o dalla gola, e legge ogni singolo pezzo di materiale genetico presente in esso. È come leggere ogni libro in una biblioteca per trovare una storia specifica, piuttosto che controllare semplicemente il catalogo. L'obiettivo è identificare qualsiasi virus, noto o sconosciuto, senza dover sapere in anticipo di cosa si tratti. Questa è un'idea potente per la preparazione alle pandemie, ma affronta un enorme ostacolo pratico. Un tampone dal naso umano è composto principalmente da cellule umane e batteri. Le vere particelle virali sono spesso rare, nascoste tra miliardi di altri frammenti genetici. Per rendere visibile il virus, gli scienziati devono prima pulire il campione per rimuovere il rumore di fondo e poi amplificare la minuscola quantità di materiale genetico virale finché non è abbastanza forte da essere udito dalle macchine di sequenziamento.

Un team di ricercatori dell'Università di Oxford e degli Oxford University Hospitals si è dato il compito di costruire un flusso di lavoro affidabile per questo compito, specificamente per i virus a RNA che infettano il sistema respiratorio. Questi sono i virus che causano il raffreddore comune, l'influenza e malattie respiratorie più gravi. I ricercatori hanno lavorato con campioni residui di pazienti che erano già stati sottoposti a test per infezioni di routine. La loro sfida era creare un processo passo dopo passo che potesse arricchire il virus, rimuovere il disordine umano e batterico e poi copiare il codice genetico virale abbastanza volte da essere rilevato da una macchina di sequenziamento, il tutto senza falsare i risultati verso un singolo tipo di virus.

Il team ha iniziato testando vari modi per separare il virus dal resto del campione. Hanno provato a far ruotare il liquido a diverse velocità per separare le cellule pesanti dalle particelle virali più leggere. Hanno anche testato metodi per rompere i gusci resistenti dei virus ed enzimi per digerire il materiale genetico libero che non faceva parte di un virus. Una parte critica del loro lavoro ha comportato il confronto di due diversi modi per copiare il materiale genetico una volta estratto. Un metodo utilizzava una tecnica chiamata amplificazione a spostamento multiplo, che si basa su un tipo specifico di enzima per copiare filamenti genetici circolarizzati. L'altro metodo, noto come amplificazione con singolo primer indipendente dalla sequenza, utilizzava una strategia diversa per copiare il materiale genetico in modo lineare.

Dopo aver eseguito estesi test, i ricercatori hanno scoperto che il metodo di copia lineare produceva costantemente risultati migliori. Rilevava più virus e generava più dati genetici rispetto al metodo circolare. Hanno poi perfezionato il processo di pulizia. Hanno scoperto che semplicemente far ruotare il campione per rimuovere le grandi cellule non era sufficiente. I risultati migliori derivavano da un approccio multi-step: prima, far ruotare il campione a una velocità moderata per rimuovere le grandi cellule umane e i detriti; secondo, trattare il liquido rimanente con un enzima che mangia il materiale genetico libero proveniente da batteri e umani, lasciando intatte le particelle virali protette; terzo, utilizzare un metodo di precipitazione chimica per raccogliere le particelle virali intatte in un pellet compatto. Questo pellet veniva poi elaborato per estrarre l'RNA.

I ricercatori hanno testato questo workflow ottimizzato su decine di campioni clinici che contenevano vari virus respiratori. Sono riusciti a rilevare una vasta gamma di patogeni, inclusi coronavirus, virus dell'influenza, virus respiratorio sinciziale e diversi tipi di rhinovirus ed enterovirus. Il processo funzionava bene per i virus che hanno un rivestimento esterno grasso, ma rimaneva più difficile rilevare i virus non avvolti, che hanno un guscio proteico più duro. Nonostante queste sfide, il team è riuscito a rilevare questi virus più difficili da trovare in diversi campioni, dimostrando che il metodo era abbastanza robusto da gestire diversi tipi di minacce respiratorie.

Durante lo sviluppo, il team ha utilizzato materiali di controllo per garantire che il processo funzionasse correttamente. Hanno aggiunto quantità note di virus innocui ai campioni per fungere da checkpoint. Un controllo era un batteriofago, un virus che infetta i batteri, che li ha aiutati a tracciare il processo di estrazione. Altri sono stati utilizzati per controllare le fasi di copia e sequenziamento. Hanno scoperto che, regolando la concentrazione di questi controlli e perfezionando i loro passaggi di pulizia, potevano rilevare in modo affidabile la presenza di questi marcatori, dando loro la fiducia che il sistema fosse abbastanza sensibile da trovare i veri virus dei pazienti.

Il workflow finale che hanno sviluppato combina questi passaggi in un processo coeso. Inizia chiarificando il campione per rimuovere i grossi detriti, seguito da un trattamento enzimatico per pulire il rumore genetico di fondo. Le restanti particelle virali vengono poi concentrate in un pellet, dal quale viene estratto l'RNA. Questo RNA viene convertito in una forma che può essere copiata e poi sequenziata utilizzando una piattaforma di sequenziamento portatile e veloce. I ricercatori hanno notato che, sebbene questo metodo sia altamente efficace, non è ancora perfetto. A volte fatica a rilevare virus presenti in numeri molto bassi o quelli con gusci particolarmente duri. Tuttavia, la capacità di rilevare un ampio spettro di virus senza dover sapere in anticipo cosa cercare rappresenta un passo avanti significativo.

Lo studio conclude che questo approccio agnostico è una via percorribile per la diagnostica futura. Offre un modo per identificare non solo i soliti sospetti, ma anche minacce virali emergenti o inaspettate. I ricercatori intendono testare questo workflow contro i test commerciali standard per vedere come si comporta in contesti clinici reali. Dimostrando di poter costruire un sistema che ascolta l'intera conversazione genetica in un campione, invece di urlare solo per un nome specifico, hanno gettato le basi per un modo più completo di monitorare e rispondere alle infezioni respiratorie. Questo lavoro suggerisce che in futuro i medici potrebbero essere in grado di utilizzare un singolo test per escludere o confermare una vasta gamma di cause virali, fornendo un quadro più chiaro di ciò che sta rendendo malato un paziente.