Development of an Agnostic Clinical Metagenomic Workflow for Respiratory RNA Viruses

技術要約：呼吸器RNAウイルスに対するアグノスティックな臨床メタゲノミクス・ワークフローの開発

問題提起
臨床メタゲノミクス（CMg）は、感染している株に関する事前の知識なしに病原体を特定できる強力なアグノスティック（非標的特異的）なアプローチを提供する。しかし、呼吸器検物へのCMgの適用には、重大な方法論的障壁が存在する。呼吸器検物、特に上気道の検物は、非標的配列（ヒトおよび細菌のDNA/RNA）が支配的な核酸抽出物を含んでおり、これがしばしばウイルスのシグナルを不明瞭にする。さらに、ウイルスの力価は数桁にわたって変動し、現在の標準的な診断法（シンドロミックPCRパネル）は限定された標的セットに依存しているため、新興株やプライマー／プローブのミスマッチが生じる株を見逃す可能性がある。著者らは、低ウイルス力価と高いバックグラウンドノイズという技術的課題に対処するため、上気道検物からのRNA呼吸器ウイルスの検出に特化して最適化された、高感度な「オールキャッチ」型ワークフローの開発を目指した。

方法論
本研究では、オックスフォード大学病院NHS財団信託からの、ウイルス輸送媒体（VTM）を含むレトロスペクティブな鼻咽頭スワブを用いた。ワークフローの開発は、以下の4つの主要コンポーネントを評価する反復プロセスに従って行われた：

1. ウイルスの濃縮およびバックグラウンドの除去： 著者らは、以下の組み合わせをテストした：

   • 示差遠心分離： 細胞デブリを除去するための低速遠心分離（3,200g）、およびウイルス粒子をペレット化するための高速遠心分離（13,200g）。
   • ヌクレアーゼ処理： 非標的の遊離核酸を分解するための、塩活性ヌクレアーゼ（M-SANおよびSAN）を用いた清澄化上清の処理。
   • ウイルス沈降： ウイルスを濃縮するための、完全なウイルス沈降試薬（PEGベース）の使用。
   • 機械的溶菌： ヌクレアーゼ処理の前にヒト細胞を破壊するためのビードビーティング。
   • RNA抽出： 非エンベロープウイルスの溶菌を改善することに焦点を当てた、商業用キット（MagMAX対Direct-zol RNA Microprep）の評価。

2. アグノスティックな増幅戦略： 2つの非特異的cDNA増幅法を並行して比較した：

   • 配列非依存的シングルプライマー増幅（SISPA）： 特異的な5'テイルを持つランダムN9プライミングを利用した、その後のPCR。
   • マルチプル・ディスプレイスメント増幅（MDA）： Phi29ポリメラーゼを用いたローリングサークル増幅のための、cDNAの環状化を含む。

3. シーケンシングおよびバイオインフォマティクス： ライブラリ作成にはOxford Nanopore Technologies（ONT）Rapid Barcoding Kitを使用し、R10.4.1フローセル上でシーケンシングを行った。リードの分類にはKraken2を用い、参照ゲノムへのマッピングにはminimap2を用いた。

4. コントロール： ワークフローには、内部プロセスコントロールとして、MS2バクテリオファージ（抽出コントロール）およびジカ、マウスレスピロウイルス、オルソレオウイルス由来のゲノムRNA（逆転写／増幅コントロール）が含まれた。

主な結果

• 増幅性能： SISPAは一貫してMDAを上回った。37個の呼吸器ウイルス陽性検物の比較において、SISPAは有意に高いリード数（中央値146リード）を示し、MDA（中央値10リード、p < 0.0001）と比較して優れていた。この結果に基づき、SISPAが最終的なワークフローに採用された。
• 濃縮の最適化： 最適なワークフローは、複数のステップを組み合わせたものである：
  1. 低速遠心分離（3,200g、30分）による清澄化。
  2. M-SANを用いた上清のヌクレアーゼ処理（37°Cで30分）。
  3. 完全なウイルス沈降のためのPEG試薬の使用。
  4. ウイルスペレットを回収するための高速遠心分離（13,200g、30分）。
  5. Direct-zol RNA Microprepキットを用いたペレットからのRNA抽出。
• 検出範囲： 最適化されたワークフローは、コロナウイルス（SARS-CoV-2、OC43、NL63、229E）、インフルエンザAおよびB、RSV、パラインフルエンザ2、3、4型、ヒトメタニューモウイルス、およびヒトライノおよびエンテロウイルスを含む、幅広い呼吸器RNAウイルスを検出することに成功した。
• 課題： 非エンベロープウイルス（特にヒトライノおよびエンテロウイルス）の検出は、エンベロープウイルスよりも困難であることが残ったが、Direct-zol抽出キットはMagMAXと比較して検出能の向上の傾向を示した。抽出コントロール（MS2）は、代替の定性的ストックを用いて大部分の検体で検出され、抽出効率が確認された。
• ゲノムカバレッジ： 高力価の検体において、ワークフローは全ゲノム決定を可能にした。コントロールウイルスのカバレッジ幅は34%から72%の範囲であり、SARS-CoV-2のカバレッジはゲノム全体にわたって観察された。

意義および主張
著者らは、臨床検物から広範なRNA呼吸器ウイルスを直接検出できる、堅牢でアグノスティックな臨床メタゲノミクス・ワークフローを開発したと主張している。本研究は、検物の複雑性が技術的な課題であるものの、前抽出濃縮（遠心分離、ヌクレアーゼ処理、沈降）とSISPA増幅を組み合わせることで、同定およびゲノム解析に十分なウイルスリードが得られることを強調している。

論文は、現在の臨床的有用性に関して控えめな立場を維持している。著者らは、本ワークフローが感度および特異性について、プロスペクティブな設定で標準的な診断法（市販のPCRパネル）に対して正式に検証されていないことを明記している。また、本手法はパンデミックへの備えや新規株の検出において有望であるものの、現時点では標的PCRと同等の感度を実現することはできないと述べている。今後の課題は、既存の診断基準に対するワークフローの性能を決定すること、および非エンベロープウイルスの安定的な検出や多段階濃縮プロセスの費用対効果に対処することである。