Development of an Agnostic Clinical Metagenomic Workflow for Respiratory RNA Viruses

Lorsqu'une personne entre dans une clinique avec une toux ou de la fièvre, les médecins doivent savoir rapidement ce qui cause la maladie. Pendant des décennies, la méthode standard pour trouver le coupable a consisté à chercher des suspects spécifiques. Si un patient présente des symptômes grippaux, un laboratoire peut effectuer un test conçu pour détecter le virus de l'influenza. Si le test revient négatif, ils peuvent en lancer un autre pour un virus différent. Cette approche fonctionne bien lorsque la liste des causes possibles est courte et bien connue. Cependant, elle est en difficulté lorsqu'un nouveau virus inconnu apparaît, ou lorsqu'un patient est infecté par un mélange de pathogènes qu'un seul test n'a pas été conçu pour identifier.

Pour résoudre ce problème, les scientifiques ont développé une méthode appelée métagénomique clinique. Au lieu de traquer un virus spécifique, cette approche prend un échantillon d'un patient, comme un écouvlement du nez ou de la gorge, et lit chaque fragment de matériel génétique présent dans celui-ci. C'est comme lire tous les livres d'une bibliothèque pour trouver une histoire spécifique, plutôt que de simplement consulter le catalogue. L'objectif est d'identifier tout virus, connu ou inconnu, sans avoir besoin de savoir ce que c'est au préalable. C'est une idée puissante pour la préparation aux pandémies, mais elle se heurte à un obstacle pratique massif. Un écouvlement du nez humain est principalement rempli de cellules humaines et de bactéries. Les véritables particules virales sont souvent rares, cachées parmi des milliards d'autres fragments génétiques. Pour rendre le virus visible, les scientifiques doivent d'abord nettoyer l'échantillon pour éliminer le bruit de fond et ensuite amplifier la minuscule quantité de matériel génétique viral jusqu'à ce qu'elle soit assez forte pour être entendue par les machines de séquençage.

Une équipe de chercheurs de l'Université d'Oxford et des hôpitaux universitaires d'Oxford s'est donné pour mission de construire un flux de travail fiable pour cette tâche, spécifiquement pour les virus à ARN qui infectent le système respiratoire. Il s'agit des virus qui causent le rhume, la grippe et d'autres maladies respiratoires plus graves. Les chercheurs ont travaillé avec des échantillons restants de patients qui avaient déjà été testés pour des infections courantes. Leur défi était de créer un processus étape par étape capable d'enrichir le virus, d'éliminer l'encombrement humain et bactérien, puis de copier le code génétique viral suffisamment de fois pour qu'il soit détecté par une machine de séquençage, le tout sans biaiser les résultats vers un seul type de virus.

L'équipe a commencé par tester diverses manières de séparer le virus du reste de l'échantillon. Ils ont essayé de faire tourner le liquide à différentes vitesses pour séparer les cellules lourdes des particules virales plus légères. Ils ont également testé des méthodes pour briser les enveloppes virales résistantes et des enzymes pour digérer le matériel génétique flottant qui ne faisait pas partie d'un virus. Une partie critique de leur travail impliquait la comparaison de deux méthodes différentes pour copier le matériel génétique une fois celui-ci extrait. Une méthode utilisait une technique appelée amplification par déplacement multiple, qui repose sur un type spécifique d'enzyme pour copier des brins génétiques circularisés. L'autre méthode, connue sous le nom d'amplification par amorce unique indépendante de la séquence, utilisait une stratégie différente pour copier le matériel génétique de manière linéaire.

Après avoir effectué de nombreux tests, les chercheurs ont constaté que la méthode de copie linéaire produisait systématiquement de meilleurs résultats. Elle détectait plus de virus et générait plus de données génétiques que la méthode circulaire. Ils ont ensuite perfectionné le processus de nettoyage. Ils ont découvert que le simple fait de faire tourner l'échantillon pour éliminer les grandes cellules ne suffisait pas. Les meilleurs résultats provenaient d'une approche en plusieurs étapes : d'abord, faire tourner l'échantillon à une vitesse modérée pour éliminer les cellules humaines et les débris volumineux ; deuxièmement, traiter le liquide restant avec une enzyme qui dévore le matériel génétique flottant provenant des bactéries et des humains, laissant derrière elle les particules virales protégées ; et troisièmement, utiliser une méthode de précipitation chimique pour rassembler les particules virales intactes en un culot serré. Ce culot était ensuite traité pour extraire l'ARN.

L'équipe a testé ce flux de travail optimisé sur des dizaines d'échantillons cliniques connus pour contenir divers virus respiratoires. Ils ont réussi à détecter une large gamme de pathogènes, y compris des coronavirus, des virus de l'influenza, le virus respiratoire syncytial, ainsi que plusieurs types de rhinovirus et d'entérovirus. Le processus fonctionnait bien pour les virus possédant une enveloppe graisseuse, mais il restait plus difficile de détecter les virus non enveloppés, qui possèdent une coque protéique plus robuste. Malgré ces défis, l'équipe a réussi à détecter ces virus plus difficiles à trouver dans plusieurs échantillons, montrant que la méthode était assez robuste pour gérer différents types de menaces respiratoires.

Tout au long du développement, l'équipe a utilisé des matériaux de contrôle pour s'assurer que son processus fonctionnait correctement. Ils ont ajouté des quantités connues de virus inoffensifs dans les échantillons pour servir de points de contrôle. L'un des contrôles était un bactériophage, un virus qui infecte les bactéries, ce qui les a aidés à suivre le processus d'extraction. D'autres étaient utilisés pour vérifier les étapes de copie et de séquençage. Ils ont constaté qu'en ajustant la concentration de ces contrôles et en affinant leurs étapes de nettoyage, ils pouvaient détecter de manière fiable la présence de ces marqueurs, ce qui leur donnait la certitude que le système était assez sensible pour trouver les vrais virus des patients.

Le flux de travail final qu'ils ont développé combine ces étapes en un processus cohérent. Il commence par la clarification de l'échantillon pour éliminer les gros débris, suivie d'un traitement enzymatique pour nettoyer le bruit génétique de fond. Les particules virales restantes sont ensuite concentrées en un culot, à partir duquel l'ARN est extrait. Cet ARN est converti en une forme qui peut être copiée et ensuite séquencée à l'aide d'une plateforme de séquençage portable et rapide. Les chercheurs ont noté que bien que cette méthode soit très efficace, elle n'est pas encore parfaite. Elle éprouve parfois des difficultés à détecter les virus présents en très faibles quantités ou ceux possédant des enveloppes particulièrement robustes. Cependant, la capacité de détecter un large spectre de virus sans avoir besoin de savoir quoi chercher à l'avance représente une avancée significative.

L'étude conclut que cette approche agnostique est une voie viable pour les diagnostics futurs. Elle offre un moyen d'identifier non seulement les suspects habituels, mais aussi les menaces virales émergentes ou inattendues. Les chercheurs prévoient de tester ce flux de travail par rapport aux tests commerciaux standards pour voir comment il se comporte dans des contextes cliniques réels. En prouvant qu'ils peuvent construire un système capable d'écouter l'intégralité de la conversation génétique dans un échantillon, plutôt que de simplement crier un nom spécifique, ils ont jeté les bases d'une manière plus complète de surveiller et de répondre aux infections respiratoires. Ce travail suggère qu'à l'avenir, les médecins pourraient être capables d'utiliser un test unique pour exclure ou confirmer une vaste gamme de causes virales, offrant ainsi une image plus claire de ce qui rend un patient malade.