Development of an Agnostic Clinical Metagenomic Workflow for Respiratory RNA Viruses

환자가 기침이나 발열 증상으로 클리닉을 방문했을 때, 의사들은 질병의 원인이 무엇인지 빠르게 파악해야 합니다. 수십 년 동안 이 범인을 찾는 표준적인 방법은 특정 용의자를 찾는 것이었습니다. 만약 환자가 독감과 유사한 증상을 보인다면, 실험실에서는 인플루엔자 바이러스를 잡아내도록 설계된 테스트를 수행할 수 있습니다. 만약 그 테스트 결과가 음성으로 나오면, 다른 바이러스를 대상으로 하는 또 다른 테스트를 수행할 수도 있습니다. 이 방식은 가능한 원인의 목록이 짧고 잘 알려져 있을 때는 효과적입니다. 하지만 새로운 미지의 바이러스가 나타나거나, 단일 테스트로는 찾아낼 수 있도록 설계되지 않은 여러 병원체가 혼합되어 환자를 감염시킨 경우에는 어려움을 겪습니다.

이를 해결하기 위해 과학자들은 임상 메타게놈(clinical metagenomics)이라고 불리는 방법을 개발했습니다. 특정 바이러스를 추적하는 대신, 이 방식은 코나 목에서 채취한 스왑과 같은 환자의 샘플을 가져와 그 안에 존재하는 모든 유전 물질을 읽어냅니다. 이는 마치 카탈로그를 확인하는 대신, 특정 이야기를 찾기 위해 도서관의 모든 책을 읽는 것과 같습니다. 목표는 무엇인지 미리 알지 못하더라도 알려진 바이러스든 알려지지 않은 바이러스든 모든 것을 식별하는 것입니다. 이는 팬데믹 대비에 있어 강력한 아이디어이지만, 거대한 실질적 장벽에 직면해 있습니다. 사람의 코에서 채취한 스왑은 대부분 인간 세포와 박테리아로 가득 차 있습니다. 실제 바이러스 입자는 수십억 개의 다른 유전적 파편들 사이에 숨겨져 매우 희귀합니다. 바이러스를 눈에 띄게 만들기 위해, 과학자들은 먼저 배경 소음을 제거하기 위해 샘프를 정제한 다음, 아주 적은 양의 바이러스 유전 물질을 시퀀싱 기계가 들을 수 있을 만큼 충분히 크게 증폭시켜야 합니다.

옥스퍼드 대학교와 옥스퍼드 대학교 병원의 연구팀은 이 작업을 위한 신뢰할 수 있는 워크플로를 구축하기 위해 노력했으며, 특히 호흡기 계통에 감염되는 RNA 바이러스를 대상으로 했습니다. 이들은 흔한 감기, 독감, 그리고 더 심각한 호흡기 질환을 일으키는 바이러스들입니다. 연구진은 이미 일상적인 감염에 대해 테스트를 마친 환자들의 남은 샘플을 활용했습니다. 그들의 과제는 바이러스를 농축하고, 인간 및 박테리아의 잡음을 제거하며, 특정 유형의 바이러스에 편향되지 않으면서도 바이러스의 유전 코드를 시퀀싱 기계에 의해 감지될 수 있을 만큼 복제하는 단계별 과정을 만드는 것이었습니다.

연구팀은 샘 샘플에서 바이러스를 분리하는 다양한 방법을 테스트하는 것으로 시작했습니다. 그들은 무거운 세포와 가벼운 바이러스 입자를 분리하기 위해 액체를 서로 다른 속도로 회전시키는 방법을 시도했습니다. 또한 단단한 바이러스 껍질을 깨뜨리는 방법과 바이러스의 일부가 아닌 자유롭게 떠다니는 유전 물질을 소화시키는 효소를 테스트했습니다. 연구의 핵심적인 부분은 추출된 유전 물질을 복제하는 두 가지 서로 다른 방식을 비교하는 것이었습니다. 한 가지 방법은 원형화된 유전 가닥을 복제하는 특정 유형의 효소에 의존하는 다중 변위 증폭(multiple displacement amplification) 기술을 사용했습니다. 다른 방법인 서열 독립적 단일 프라이머 증폭(sequence-independent single primer amplification)은 유전 물질을 선형적으로 복제하는 다른 전략을 사용했습니다.

광범위한 테스트를 거친 후, 연구진은 선형 복제 방식이 일관되게 더 나은 결과를 생성한다는 것을 발견했습니다. 이 방식은 원형 방식보다 더 많은 바이러스를 탐지하고 더 많은 유전 데이터를 생성했습니다. 그 후 연구진은 정제 과정을 개선했습니다. 단순히 세포를 제거하기 위해 샘플을 회전시키는 것만으로는 충분하지 않다는 것을 발견했습니다. 최상의 결과는 다단계 접근 방식에서 나왔습니다. 첫째, 큰 인간 세포와 잔해를 제거하기 위해 중간 속도로 샘플을 회전시키고, 둘째, 남은 액체를 박테리아와 인간으로부터 유래한 자유 유전 물질을 먹어 치워 보호된 바이러스 입자만을 남기는 효소로 처리한 다음, 셋째, 화학적 침전법을 사용하여 온전한 바이러스 입자를 단단한 펠릿(pellet) 형태로 모으는 방식이었습니다. 이 펠릿은 이후 RNA를 추출하는 데 사용되었습니다.

연구진은 최적화된 워크플로를 다양한 호흡기 바이러스를 포함하고 있는 것으로 알려진 수십 개의 임상 샘플에 적용하여 테스트했습니다. 그들은 코로나바이러스, 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV), 그리고 여러 종류의 리노바이러스와 엔테로바이러스를 포함한 광범위한 병원체를 성공적으로 탐지했습니다. 이 과정은 지방질 외피를 가진 바이러스에는 잘 작동했지만, 단백질 껍질이 더 단단한 비외피(non-enveloped) 바이러스를 탐지하는 데는 여전히 더 어려움이 있었습니다. 이러한 어려움에도 불구하고, 연구팀은 몇몇 샘플에서 이러한 찾기 어려운 바이러스들을 탐지해 냈으며, 이는 이 방법이 다양한 유형의 호흡기 위협을 처리할 수 있을 만큼 견고하다는 것을 보여주었습니다.

개발 과정 전반에 걸쳐 연구팀은 프로세스가 올바르게 작동하는지 확인하기 위해 대조 물질을 사용했습니다. 그들은 체크포인트 역할을 할 수 있도록 알려진 양의 해롭지 않은 바이러스를 샘플에 추가했습니다. 하나의 대조군은 박테리아를 감염시키는 바이러스인 박테리오파지였으며, 이는 추출 과정을 추적하는 데 도움을 주었습니다. 다른 대조군들은 복제 및 시퀀싱 단계를 확인하는 데 사용되었습니다. 연구진은 이 대조물들의 농도를 조절하고 정제 단계를 개선함으로써 이 표지자들을 신뢰성 있게 탐지할 수 있었고, 이를 통해 시스템이 실제 환자의 바이러스를 찾아낼 수 있을 만큼 민감하다는 확신을 얻었습니다.

그들이 개발한 최종 워크플로는 이러한 단계들을 하나의 응집된 과정으로 결합합니다. 이는 큰 잔해를 제거하기 위해 샘플을 명확히 하는 것으로 시작하여, 배경 유전 노이즈를 제거하기 위한 효소 처리를 따릅니다. 남은 바이러스 입자는 펠릿으로 농축되며, 여기서 RNA가 추출됩니다. 이 RNA는 복제 가능한 형태로 전환된 후 휴대용 고속 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 시퀀싱됩니다. 연구진은 이 방법이 매우 효과적이긴 하지만 아직 완벽하지는 않다고 언급했습니다. 이 방법은 바이러스가 매우 적은 수로 존재하거나 특히 단단한 껍질을 가진 경우 탐지에 어려움을 겪기도 합니다. 그러나 무엇을 찾아야 할지 미리 알지 못해도 광범위한 스펙트럼의 바이러스를 탐지할 수 있는 능력은 중요한 진전을 의미합니다.

연구는 이 불가지론적(agnostic) 접근 방식이 미래의 진단을 위한 실행 가능한 경로라고 결론짓습니다. 이는 일반적인 용의자뿐만 아니라 새롭게 등장하거나 예상치 못한 바이러스 위협을 식별할 수 있는 방법을 제공합니다. 연구진은 이 워크플로를 표준 상업용 테스트와 비교하여 실제 임상 환경에서 어떻게 작동하는지 테스트할 계획입니다. 특정 이름 하나만을 외치는 것이 아니라 샘플 내의 전체 유전적 대화를 경청할 수 있는 시스템을 구축할 수 있음을 입증함으로써, 그들은 더 포괄적인 호흡기 감염 모니터링 및 대응을 위한 토대를 마련했습니다. 이 연구는 미래에 의사들이 단 한 번의 테스트로 다양한 바이러스 원인을 배제하거나 확진할 수 있어, 환자를 아프게 하는 원인이 무엇인지에 대해 더 명확한 그림을 제공할 수 있음을 시사합니다.