Development of an Agnostic Clinical Metagenomic Workflow for Respiratory RNA Viruses

Wenn eine Person mit Husten oder Fieber in eine Klinik kommt, müssen Ärzte schnell wissen, was die Ursache der Erkrankung ist. Jahrzehntelang war die Standardmethode, den Übeltäter zu finden, nach spezifischen Verdächtigen zu suchen. Wenn ein Patient grippeähnliche Symptome hat, lässt ein Labor möglicherweise einen Test durchführen, der auf das Influenza-Virus ausgelegt ist. Wenn dieser Test negativ ausfällt, wird möglicherweise ein weiterer Test für ein anderes Virus durchgeführt. Dieser Ansatz funktioniert gut, wenn die Liste der möglichen Ursachen kurz und bekannt ist. Er stößt jedoch an seine Grenzen, wenn ein neues, unbekanntes Virus auftaucht oder wenn ein Patient mit einer Mischung aus Pathogenen infiziert ist, die ein einzelnes Testverfahren nicht erfassen kann.

Um dies zu lösen, haben Wissenschaftler eine Methode namens klinische Metagenomik entwickelt. Anstatt nach einem spezifischen Virus zu jagen, nimmt dieser Ansatz eine Probe von einem Patienten, wie etwa einen Abstrich aus der Nase oder dem Rachen, und liest jedes einzelne Stück des vorhandenen genetischen Materials aus. Es ist so, als würde man jedes Buch in einer Bibliothek lesen, um eine bestimmte Geschichte zu finden, anstatt nur den Katalog zu prüfen. Das Ziel ist es, jedes Virus, bekannt oder unbekannt, zu identifizieren, ohne vorher wissen zu müssen, worum es sich handelt. Dies ist eine kraftvolle Idee für die Pandemie-Vorsorge, aber sie steht vor einer massiven praktischen Hürde. Ein Abstrich aus einer menschlichen Nase ist hauptsächlich mit menschlichen Zellen und Bakterien gefüllt. Die eigentlichen Viruspartikel sind oft selten und zwischen Milliarden anderer genetischer Fragmente verborgen. Um das Virus sichtbar zu machen, müssen Wissenschaftler die Probe zuerst reinigen, um das Hintergrundrauschen zu entfernen, und dann die winzige Menge an viralem genetischem Material so weit verstärken, bis es laut genug ist, um von den Sequenziergeräten gehört zu werden.

Ein Forschungsteam der University of Oxford und der Oxford University Hospitals setzte sich zum Ziel, einen zuverlässigen Arbeitsablauf für diese Aufgabe zu entwickeln, insbesondere für RNA-Viren, die das Atmungssystem infizieren. Dies sind die Viren, die die gewöhnliche Erkältung, die Grippe und schwerere Atemwegserkrankungen verursachen. Die Forscher arbeiteten mit Restproben von Patienten, die bereits auf Routineinfektionen getestet worden waren. Ihre Herausforderung bestand darin, einen schrittweisen Prozess zu entwickeln, der das Virus anreichert, den menschlichen und bakteriellen „Müll“ entfernt und dann den viralen genetischen Code so oft kopiert, dass er von einer Sequenziermaschine erkannt werden kann, ohne dabei die Ergebnisse in Richtung eines einzelnen Typus von Virus zu verzerren.

Das Team begann damit, verschiedene Wege zu testen, um das Virus vom Rest der Probe zu trennen. Sie versuchten, die Flüssigkeit mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten zu zentrifugieren, um schwere Zellen von leichteren Viruspartikeln zu trennen. Sie testeten auch Methoden, um zähe Virushüllen aufzubrechen, sowie Enzyme, um das frei schwimmende genetische Material zu verdauen, das nicht Teil eines Virus war. Ein entscheidender Teil ihrer Arbeit war der Vergleich zweier verschiedener Arten, das genetische Material nach der Extraktion zu kopieren. Eine Methode nutzte eine Technik namens Multiple Displacement Amplification, die auf einem speziellen Enzym basiert, das kreisförmige genetische Stränge kopiert. Die andere Methode, bekannt als Sequence-Independent Single Primer Amplification, nutzte eine andere Strategie, um das genetische Material linear zu kopieren.

Nach umfangreichen Tests fanden die Forscher heraus, dass die lineare Kopiermethode konsequent bessere Ergebnisse lieferte. Sie detektierte mehr Viren und generierte mehr genetische Daten als die kreisförmige Methode. Danach verfeinerten sie den Reinigungsprozess. Sie entdeckten, dass das bloße Zentrifugieren der Probe, um große Zellen zu entfernen, nicht ausreichte. Die besten Ergebnisse wurden durch einen mehrstufigen Ansatz erzielt: erstens das Zentrifugieren der Probe bei einer moderaten Geschwindigkeit, um große menschliche Zellen und Trümmer zu entfernen; zweitens die Behandlung der verbleibenden Flüssigkeit mit einem Enzym, das das frei schwimmende genetische Material von Bakterien und Menschen „auffrisst“ und die geschützten Viruspartikel zurücklässt; und drittens die Verwendung einer chemischen Fällungsmethode, um die intakten Viruspartikel in einem dichten Pellet zu sammeln. Dieses Pellet wurde anschließend verarbeitet, um die RNA zu extrahieren.

Die Forscher testeten diesen optimierten Arbeitsablauf an Dutzenden von klinischen Proben, die bekanntermaßen verschiedene respiratorische Viren enthielten. Sie konnten erfolgreich eine breite Palette von Pathogenen nachweisen, darunter Coronaviren, Influenza-Viren, das Respiratorische Syncytial-Virus sowie mehrere Arten von Rhinoviren und Enteroviren. Der Prozess funktionierte gut für Viren, die eine fettige Außenhülle besitzen, blieb jedoch schwieriger bei der Detektion von Nicht-enveloped-Viren, die eine zähere Proteinhülle aufweisen. Selbst angesichts dieser Herausforderungen gelang es dem Team, diese schwerer zu findenden Viren in mehreren Proben nachzuweisen, was zeigte, dass die Methode robust genug war, um verschiedene Arten von Atemwegsbedrohungen zu bewältigen.

Während der gesamten Entwicklung nutzte das Team Kontrollmaterialien, um sicherzustellen, dass ihr Prozess korrekt funktionierte. Sie fügten bekannte Mengen harmloser Viren zu den Proben hinzu, die als Kontrollpunkte dienten. Eine Kontrolle war ein Bakteriophage, ein Virus, das Bakterien infiziert, welcher ihnen half, den Extraktionsprozess zu verfolgen. Andere wurden verwendet, um die Kopier- und Sequenzierschritte zu überprüfen. Sie fanden heraus, dass sie durch Anpassung der Konzentration dieser Kontrollen und die Verfeinerung ihrer Reinigungsschritte die Anwesenheit dieser Marker zuverlässig nachweisen konnten, was ihnen die Gewissheit gab, dass das System sensitiv genug war, um echte Patientenviren zu finden.

Der endgültige Arbeitsablauf, den sie entwickelten, kombiniert diese Schritte zu einem kohärenten Prozess. Er beginnt mit der Klärung der Probe, um große Trümmer zu entfernen, gefolgt von einer enzymatischen Behandlung, um das genetische Hintergrundrauschen zu bereinigen. Die verbleibenden Viruspartikel werden dann in ein Pellet konzentriert, aus dem die RNA extrahiert wird. Diese RNA wird in eine Form umgewandelt, die kopiert und dann mit einer tragbaren, Hochgeschwindigkeits-Sequenzierplattform sequenziert werden kann. Die Forscher merkten an, dass diese Methode zwar sehr effektiv, aber noch nicht perfekt sei. Sie habe manchmal Schwierigkeiten, Viren zu detektieren, die in sehr geringen Zahlen vorhanden sind oder besonders zähe Hüllen besitzen. Dennoch stellt die Fähigkeit, ein breites Spektrum an Viren zu identifizieren, ohne im Voraus wissen zu müssen, wonach man sucht, einen bedeutenden Fortschritt dar.

Die Studie kommt zu dem Schluss, dass dieser agnostische Ansatz ein lebensfähiger Weg für zukünftige Diagnostika ist. Er bietet eine Möglichkeit, nicht nur die üblichen Verdächtigen, sondern auch aufkommende oder unerwartete virale Bedrohungen zu identifizieren. Die Forscher planen, diesen Arbeitsablauf gegen Standard-Kommerztests zu testen, um zu sehen, wie er sich in realen klinischen Umgebungen schlägt. Indem sie bewiesen haben, dass sie ein System bauen können, das dem gesamten genetischen Gespräch in einer Probe zuhört, anstatt nur nach einem spezifischen Namen zu rufen, haben sie den Grundstein für eine umfassendere Überwachung und Reaktion auf Atemwegsinfektionen gelegt. Diese Arbeit legt nahe, dass Ärzte in Zukunft möglicherweise in der Lage sein werden, einen einzigen Test einzusetzen, um eine Vielzahl viraler Ursachen auszuschließen oder zu bestätigen, was ein klareres Bild davon liefert, was einen Patienten krank macht.