Development of an Agnostic Clinical Metagenomic Workflow for Respiratory RNA Viruses

Wanneer een persoon een kliniek binnenloopt met een hoest of koorts, moeten artsen snel weten wat de oorzaak van de ziekte is. Decennialang was de standaardmanier om de schuldige te vinden het zoeken naar specifieke verdachten. Als een patiënt griepachtige symptomen heeft, kan een laboratorium een test uitvoeren die ontworpen is om het influenzavirus te vangen. Als de test negatief uitvalt, kunnen ze een andere test uitvoeren voor een ander virus. Deze aanpak werkt goed wanneer de lijst met mogelijke oorzaken kort en bekend is. Het heeft echter moeite wanneer er een nieuw, onbekend virus verschijnt, of wanneer een patiënt geïnfecteerd is met een mix van pathogenen die geen enkele test heeft ontworpen om te vinden.

Om dit op te lossen, hebben wetenschappers een methode ontwikkeld genaamd klinische metagenomica. In plaats van te jagen op één specifiek virus, neemt deze aanpak een monster van een patiënt, zoals een swab uit de neus of keel, en leest elk stukje genetisch materiaal dat er aanwezig is. Het is alsof je elk boek in een bibliotheek leest om een specifiek verhaal te vinden, in plaats van alleen de catalogus te controleren. Het doel is om elk virus te identificeren, bekend of onbekend, zonder vooraf te hoeven weten wat het is. Dit is een krachtig idee voor pandemische paraatheid, maar het staat voor een enorme praktische hindernis. Een swab uit een menselijke neus is grotendeels gevuld met menselijke cellen en bacteriën. De werkelijke virusdeeltjes zijn vaak zeldzaam en verborgen tussen miljarden andere genetische fragmenten. Om het virus zichtbaar te maken, moeten wetenschappers de steekproef eerst schoonmaken om de achtergrondruis te verwijderen en vervolgens de kleine hoeveelheid viraal genetisch materiaal versterken totdat het hard genoeg is om gehoord te worden door de sequencingmachines.

Een team onderzoekers aan de Universiteit van Oxford en Oxford University Hospitals zette zich in om een betrouwbare workflow voor deze taak te bouwen, specifiek voor RNA-virussen die het ademhalingsstelsel infecteren. Dit zijn de virussen die verkoudheid, griep en meer ernstige luchtwegaandoeningen veroorzaken. De onderzoekers werkten met overgebleven monsters van patiënten die al getest waren op routinematige infecties. Hun uitdaging was om een stapsgewijs proces te creëren dat het virus verrijkt, de menselijke en bacteriële rommel verwijdert, en vervolgens de virale genetische code genoeg keren kopieert om gedetecteerd te worden door een sequencingmachine, en dat alles zonder de resultaten te bevoordelen richting een specifiek type virus.

Het team begon met het testen van verschillende manieren om het virus van de rest van het monster te scheiden. Ze probeerden de vloeistof met verschillende snelheden te centrifugeren om zware cellen van lichtere virusdeeltjes te scheiden. Ze testten ook methoden om taaiere virusomhulsels open te breken en enzymen om het vrij zwevende genetische materiaal te verteren dat niet deel uitmaakte van een virus. Een cruciaal onderdeel van hun werk was het vergelijken van twee verschillende manieren om het genetische materiaal te kopiëren nadat het was geëxtraheerd. Eén methode maakte gebruik van een techniek genaamd multiple displacement amplification, die vertrouwt op een specifiek type enzym om gecirkulariseerde genetische strengen te kopiëren. De andere methode, bekend als sequence-independent single primer amplification, gebruikte een andere strategie om het genetische materiaal lineair te kopiëren.

Na het uitvoeren van uitgebreide tests ontdekten de onderzoekers dat de lineaire kopieermethode consequent betere resultaten opleverde. Het detecteerde meer virussen en genereerde meer genetische data dan de circulaire methode. Vervolgens verfijnden ze het reinigingsproces. Ze ontdekten dat het simpelweg centrifugeren van het monster om grote cellen te verwijderen niet voldoende was. De beste resultaten kwamen voort uit een meerstaps aanpak: eerst het monster met een matige snelheid centrifugeren om grote menselijke cellen en resten te verwijderen; ten tweede de resterende vloeistof behandelen met een enzym dat het vrij zwevende genetische materiaal van bacteriën en mensen opeet, waardoor de beschermde virusdeeltjes achterblijven; en ten derde een chemische precipitatiemethode gebruiken om de intacte virusdeeltjes in een compact pellet te verzamelen. Dit pellet werd vervolgens verwerkt om het RNA te extraheren.

De onderzoekers testten deze geoptimaliseerde workflow op tientallen klinische monsters die bekend stonden te verschillende respiratoire virussen te bevatten. Ze slaagden erin een breed scala aan pathogenen te detecteren, waaronder coronavirussen, influenzavirussen, respiratoir syncytieel virus, en verschillende soorten rhino- en enterovirussen. Het proces werkte goed voor virussen die een vettige buitenlaag hebben, maar het bleef moeilijker om niet-omhulde virussen te detecteren, die een taaiere eiwitmantel hebben. Ondanks deze uitdagingen slaagde het team erin om deze moeilijker te vinden virussen in verschillende monsters te detecteren, wat aantoonde dat de methode robuust genoeg was om verschillende soorten respiratoire dreigingen aan te kunnen.

Gedurende de hele ontwikkeling gebruikten het team controlematerialen om te waarborgen dat hun proces correct werkte. Ze voegden bekende hoeveelheden onschadelijke virussen toe aan de monsters om als controlepunten te dienen. Eén controle was een bacteriofaag, een virus dat bacteriën infecteert, wat hen hielp het extractieproces te volgen. Anderen werden gebruikt om de kopiëring en sequencingstappen te controleren. Ze ontdekten dat door de concentratie van deze controles aan te passen en hun reinigingsstappen te verfijnen, ze betrouwbaar de aanwezigheid van deze markers konden detecteren, wat hen het vertrouwen gaf dat het systeem gevoelig genoeg was om echte patiëntvirussen te vinden.

De uiteindelijke workflow die zij ontwikkelden combineert deze stappen in een samenhangend proces. Het begint met het verhelderen van het monster om groot afval te verwijderen, gevolgd door een enzymatische behandeling om de genetische achtergrondruis op te schonen. De resterende virusdeeltjes worden vervolgens geconcentreerd in een pellet, waaruit het RNA wordt geëxtraheerd. Dit RNA wordt omgezet in een vorm die gekopieerd kan worden en vervolgens gesequenced kan worden met een draagbaar, hoogsnelheids sequencingplatform. De onderzoekers merkten op dat hoewel deze methode zeer effectief is, deze nog niet perfect is. Het heeft soms moeite met het detecteren van virussen die in zeer lage aantallen aanwezig zijn of die een bijzonder taaie schil hebben. Echter, het vermogen om een breed spectrum aan virussen te detecteren zonder vooraf te weten waarnaar men moet zoeken, vertegenwoordigt een belangrijke stap voorwaarts.

De studie concludeert dat deze agnostische aanpak een levensvatbaar pad is voor toekomstige diagnostiek. Het biedt een manier om niet alleen de gebruikelijke verdachten te identificeren, maar ook opkomende of onverwachte virale dreigingen. De onderzoekers zijn van plan deze workflow te testen tegen standaard commerciële tests om te zien hoe deze presteert in echte klinische omgevingen. Door te bewijzen dat ze een systeem kunnen bous dat het volledige genetische gesprek in een monster beluistert, in plaats van alleen maar hardop naar één specifieke naam te roepen, hebben ze de basis gelegd voor een meer uitgebreide manier om respiratoire infecties te monitoren en erop te reageren. Dit werk suggereert dat artsen in de toekomst mogelijk één enkele test kunnen gebruiken om een breed scala aan virale oorzaken uit te sluiten of te bevestigen, wat een duidelijker beeld geeft van wat een patiënt ziek maakt.