A cell-permeable pyranine derivative as new fluorescent substrate for human UDP- glucuronosyltransferase and sulfotransferase enzymes

कल्पना कीजिए कि आपका शरीर एक हलचल भरा, उच्च-सुरक्षा वाला शहर है। हर दिन, इसे विदेशी आगंतुकों का सामना करना पड़ता है—भोजन, दवा और पर्यावरण से आने वाले रसायन—जिन्हें यह पहचानता नहीं है। शहर को सुरक्षित रखने के लिए, इसके पास एक विशेष सफाई दल है। यह दल केवल कचरा बाहर नहीं फेंकता; वे इन घुसपैठियों पर विशेष "टैग" लगाते हैं, जिससे वे पानी में घुलनशील पैकेटों में बदल जाते हैं जिन्हें मूत्र या पित्त के माध्यम से आसानी से बहाया जा सकता है। इस प्रक्रिया को मेटाबॉलिज्म (चयापचय) कहा जाता है, और दो मुख्य टैगर एंजाइम हैं जिन्हें UGTs (जो ग्लुकुरोनिक एसिड टैग जोड़ते हैं) और SULTs (जो सल्फेट टैग जोड़ते हैं) कहा जाता है। वैज्ञानिक लंबे समय से जीवित कोशिकाओं के भीतर इस टैगिंग प्रक्रिया को वास्तविक समय में देखना चाहते थे, लेकिन यह आमतौर पर एक जादूगर की ट्रिक को अंधेरे में देखने जैसा होता है: आप जानते हैं कि कुछ हो रहा है, लेकिन आप सब कुछ रोककर और उसे अलग किए बिना विवरण नहीं देख सकते।

फ्लोरोसेंट केमिस्ट्री (प्रतिदीप्ति रसायन विज्ञान) की दुनिया में प्रवेश करें। फ्लोरोसेंट रंगों के बारे में सोचें जैसे कि वे छोटे, चमकते जुगनू हैं जिनका उपयोग वैज्ञानिक जैविक प्रक्रियाओं को रोशन करने के लिए कर सकते हैं। यदि आप एक जुगनू को रंग बदलने के लिए प्रेरित कर सकें जब उस पर एक टैग लगाया जाता है, तो आप वास्तविक समय में सफाई दल को काम करते हुए देख सकते हैं। बड़ा सवाल यह था: क्या हम एक ऐसा "स्मार्ट जुगनू" ढूंढ सकते हैं जो कोशिका में घुसने के लिए पर्याप्त छोटा हो, दिखने के लिए पर्याप्त चमकीला हो, और पर्याप्त संवेदनशील हो कि जैसे ही कोई UGT या SULT एंजाइम अपना काम करे, वह अपना रंग बदल सके? यदि हम ऐसा कर पाते, तो हम न केवल यह माप पाते कि सफाई दल कितनी तेजी से काम करता है; हम वास्तव में यह भी देख पाते कि कौन सी कोशिकाएं कड़ी मेहनत कर रही हैं और कौन सी सुस्ती दिखा रही हैं, और वह भी कोशिका को नष्ट किए बिना।

यही वह कहानी है जिसे रिस्टो ओ. जुवेन (Risto O. Juvonen) और उनकी टीम ने बताने का प्रयास किया। उन्होंने एक नया रसायन खोजा जिसे वे "F-pyrene" कहते हैं, जो पायरेनाइन (pyranine) नामक अणु का एक व्युत्पन्न (derivative) है। F-pyrene को एक चमकते हरे जुगनू के रूप में सोचें जो इतना छोटा और चालाक है कि वह एक लिवर कोशिका (विशेष रूप से, एक मानव लिवर सेल लाइन जिसे HepG2 कहा जाता है) के दरवाजे से आसानी से फिसल कर अंदर जा सकता है। एक बार अंदर जाने के बाद, जादू होता है। शोधकर्ताओं ने देखा कि जबकि कोशिका शुरू में चमकीले, खुशहाल हरे रंग में चमक रही थी, कोशिकाओं का एक हिस्सा रंग बदलने लगा, और एक ठंडे, इलेक्ट्रिक नीले रंग में बदल गया।

टीम ने परिकल्पना की कि यह रंग परिवर्तन कोई त्रुटि नहीं था, बल्कि काम किए जाने का एक संकेत था। उन्हें संदेह था कि कोशिका के टैगिंग एंजाइम F-pyrene को पकड़ रहे हैं और उस पर ग्लुकुरोनिक एसिड या सल्फेट टैग लगा रहे हैं। एक गिरगिट की तरह जो अपनी त्वचा बदलता है, F-pyrene ने टैग लगने के बाद अपना "चमक" हरे से नीले में बदल लिया। इसे साबित करने के लिए, उन्होंने केवल अनुमान नहीं लगाया; उन्होंने प्रयोगों की एक श्रृंखला आयोजित की जो एक फोरेंसिक जांच की तरह काम करती थी।

सबसे पहले, उन्होंने पुष्टि की कि F-pyrene वास्तव में एक "सेल-परमीएबल" (कोशिका में प्रवेश करने योग्य) जासूस है। जब उन्होंने इसे लिवर कोशिकाओं के कल्चर में डाला, तो कोशिकाओं ने इसे लगभग तुरंत सोख लिया, और दो मिनट के भीतर वे हरी हो गईं। जैसे-जैसे समय बीतता गया, कुछ कोशिकाओं में हरा रंग फीका पड़ने लगा और उसकी जगह नीले धब्बे दिखाई देने लगे। एक उच्च-शक्ति वाले सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके जो प्रकाश को उसके सटीक रंगों में अलग कर सकता है, उन्होंने साबित किया कि हरा प्रकाश (535 nm पर उत्सर्जित) बिना टैग वाला F-pyrene था, जबकि नीला प्रकाश (460 nm पर उत्सर्जित) टैग वाला संस्करण था। यह एक महत्वपूर्ण खोज थी क्योंकि अन्य कई रंगों के विपरीत, जो मेटाबोलाइज होने पर केवल काला पड़ जाते हैं, F-pyrene के टैग वास्तव में एक अलग रंग में चमकते हैं। इसका मतलब है कि वैज्ञानिक "पहले" और "बाद" को एक साथ देख सकते हैं, जैसे अपनी आँखों के सामने एक हरे रंग की गेंद को नीली गेंद में बदलते हुए देखना।

इसके बाद, टीम जानना चाहती थी कि कौन से एंजाइम इस रंग बदलने वाले जादू के लिए जिम्मेदार हैं। उन्होंने मानव लिवर और आंतों में पाए जाने वाले एंजाइमों के पुस्तकालय के विरुद्ध F-pyrene का परीक्षण किया। उन्होंने पाया कि F-pyrene UGT एंजाइमों के एक विशिष्ट समूह (विशेष रूप से UGT1A1, 1A3, 1A7, 1A8, 1A9, और 1A10) और SULT एंजाइमों के एक चुनिष्ट समूह (SULT1A1, 1A2, 1E1, और 2A1) का पसंदीदा भोजन था। जब ये एंजाइम मौजूद थे, तो हरा फ्लोरेसेंस कम हो गया और नीला फ्लोरेसेंस बढ़ गया।

शोधकर्ताओं ने यह भी मापा कि ये एंजाइम कितनी तेजी से काम करते हैं। मानव लिवर नमूनों में, ग्लुकुरोनाइडेशन की दर (UGTs के माध्यम से हरे-से-नीले का स्विच) 5.10 ± 0.14 nmol/(sg prot) थी, जबकि आंत में, यह 2.9 ± 0.46 nmol/(sg prot) थी। सल्फोनेशन (SULTs के माध्यम से स्विच) के लिए, लिवर दर 0.063 ± 0.026 nmol/(sg prot) और आंत दर 0.199 ± 0.007 nmol/(sg prot) थी। दिलचस्प बात यह है कि उन्होंने पाया कि लिवर ग्लुकुरोनाइडेशन में आंत की तुलना में बहुत बेहतर था, लेकिन आंत सल्फोनेशन में वास्तव में तेज था।

उनकी खोज का सबसे आकर्षक हिस्सा यह था कि एंजाइम कैसे व्यवहार करते हैं। अधिकांश एंजाइम एक सरल नियम का पालन करते हैं: अधिक भोजन (सब्सट्रेट) equals अधिक काम, एक सीमा तक। हालांकि, टीम ने पाया कि F-pyrene पर काम करने वाले अधिकांश एंजाइम एक "सब्सट्रेट इनहिबिशन" (सब्सट्रेट अवरोध) पैटर्न का पालन करते हैं। कल्पना कीजिए कि एक फैक्ट्री वर्कर जो बक्सों के ढेर से इतना अभिभूत हो जाता है कि वह उन पर ठोकर खाने लगता है और धीमा काम करने लगता है। यहाँ भी यही हुआ: जब बहुत अधिक F-pyrene था, तो एंजाइमों ने वास्तव में अपनी गति धीमी कर दी। केवल एक एंजाइम, SULT2A1, मानक, अनुमानित नियमों का पालन करता था।

टीम ने यह भी जांचा कि क्या F-pyမြင် F-pyrene कोशिकाओं के लिए विषाक्त है। उन्होंने पाया कि प्रयोगों में उपयोग की गई सांद्रता पर कोशिकाएं स्वस्थ और जीवित रहीं, केवल बहुत अधिक खुराक (40 µM से ऊपर) पर तनाव के लक्षण दिखाए। इसने पुष्टि की कि F-pyrene जीवित कोशिकाओं में इन प्रक्रियाओं को देखने के लिए एक सुरक्षित, गैर-विषाक्त उपकरण है।

अंत में, लेखकों ने निष्कर्ष निकाला कि F-pyrene एक बहुमुखी नया उपकरण है। यह केवल एक रंग (dye) नहीं है; यह एक रिपोर्टर है जो हमें बता सकता है कि कौन सी कोशिकाएं सक्रिय रूप से दवाओं को मेटाबोलाइज कर रही हैं और कौन से एंजाइम भारी काम कर रहे हैं। चूंकि बिना टैग वाला संस्करण हरा है और टैग किए गए संस्करण नीले हैं, शोधकर्ता इसका उपयोग परिवहन और चयापचय को एक साथ देखने के लिए कर सकते हैं। उन्होंने यह भी सुझाव दिया कि चूंकि अलग-अलग कोशिकाएं अलग-अलग दरों पर नीली हुईं, इसलिए इस उपकरण का उपयोग संभावित रूप से कोशिकाओं को इस आधार पर छांटने के लिए किया जा सकता है कि वे रसायनों को विषमुक्त करने में कितनी अच्छी हैं। यह एक छोटा, चमकता हुआ अणु है जो हमारे शरीर के घर की सफाई करने के छिपे हुए संसार में एक बड़ी, रंगीन खिड़की खोलता है।