A cell-permeable pyranine derivative as new fluorescent substrate for human UDP- glucuronosyltransferase and sulfotransferase enzymes

Stel je voor dat je lichaam een bruisende, beveiligde stad is. Elke dag wordt het geconfronteerd met een stroom van vreemde bezoekers—chemicaliën uit voedsel, medicijnen en de omgeving—die het niet herkent. Om de stad veilig te houden, heeft het een gespecialiseerde schoonmaakploeg. Deze ploeg gooit de rommel niet zomaar weg; ze bevestigen speciale "labels" aan deze indringers, waardoor ze veranderen in wateroplosbare pakketjes die gemakkelijk kunnen worden weggespoeld via de urine of gal. Dit proces wordt metabolisme genoemd, en de twee belangrijkste labelmakers zijn enzymen genaamd UGT's (die een glucuronzuur-label toevoegen) en SULT's (die een sulfaat-label toevoegen). Wetenschappers willen dit labelproces al lang in realtime binnen levende cellen observeren, maar het is meestal alsof je een goocheltruc in het donker probeert te bekijken: je weet dat er iets gebeurt, maar je kunt de details niet zien zonder de show te stoppen en alles uit elkaar te halen.

Betreed de wereld van de fluorescente chemie. Denk aan fluorescente kleurstoffen als kleine, gloeiende vuurvliegjes die wetenschappers kunnen gebruiken om biologische processen te verlichten. Als je een vuurvliegje van kleur kunt laten veranderen wanneer er een label aan wordt bevestigd, kun je de schoonmaakploeg in realtime aan het werk zien. De grote vraag is geweest: Kunnen we een "slim vuurvliegje" vinden dat klein genoeg is om een cel binnen te sluipen, helder genoeg is om gezien te worden, en gevoelig genoeg is om van kleur te veranderen op het moment dat een UGT- of SULT-enzym zijn werk doet? Als we dat zouden kunnen, zouden we niet alleen kunnen meten hoe snel de schoonmaakploeg werkt; we zouden ook daadwerkelijk kunnen zien welke cellen hard werken en welke aan het achterlopen zijn, allemaal zonder de cel te vernietigen.

Dit is precies het verhaal dat Risto O. Juvonen en zijn team wilden vertellen. Ze ontdekten een nieuwe chemische stof die ze "F-pyreen" noemen, een derivaat van een molecuul genaamd pyranine. Denk aan F-pyreen als een gloeiend groen vuurvliegje dat klein en sluw genoeg is om dwars door de voordeur van een levercel (specifiek een menselijke levercellijn genaamd HepG2) te glippen. Eenmaal binnen vindt de magie plaats. De onderzoekers observeerden dat terwijl de cel aanvankelijk fel en vrolijk groen gloeide, een deel van de cellen van kleur begon te verschieten, naar een koel, elektrisch blauw.

Het team vermoedde dat deze kleurverandering geen foutje was, maar een teken van werk dat werd verricht. Ze vermoedden dat de label-enzymen van de cel de F-pyreen grepen en er ofwel een glucuronzuur- of een sulfaat-label aan bevestigden. Net zoals een kameleon van huid van kleur verandert, veranderde de F-pyreen zijn "gloed" van groen naar blauw zodra deze getagd was. Om dit te bewijzen, hebben ze niet alleen geraden; ze zetten een reeks experimenten op die fungeerden als een forensisch onderzoek.

Eerst bevestigden ze dat F-pyreen inderdaad een "cel-permeabele" spion is. Wanneer ze het toevoegden aan een kweek van levercellen, smulden de cellen het bijna onmiddellijk op, waardoor ze binnen twee minuten groen werden. Naarmate de tijd verstreek, begon de groene gloed in sommige cellen te vervagen, vervangen door blauwe plekken. Door een krachtige microscoop te gebruiken die licht in zijn exacte kleuren kan scheiden, bewezen ze dat het groene licht (uitgezonden bij 535 nm) de ongetagde F-pyreen was, terwijl het blauwe licht (uitgezonden bij 460 nm) de getagde versie was. Dit was een cruciale ontdekking omdat, in tegenstelling tot veel andere kleurstoffen die simpelweg donker worden wanneer ze worden gemetaboliseerd, de labels van F-pyrene daadwerkelijk in een andere kleur gloeien. Dit betekent dat wetenschappers het "voor" en "na" simultaan kunnen bekijken, alsof ze een groene bal zien veranderen in een blauwe bal vlak voor hun ogen.

Vervolgens wilden het team weten welke enzymen precies verantwoordelijk waren voor deze kleurveranderende magie. Ze testten F-pyreen tegen een bibliotheek van menselijke enzymen die in de lever en de darmen worden gevonden. Ze ontdekten dat F-pyreen een favoriet hapje was voor een specifieke groep UGT-enzymen (specifiek UGT1A1, 1A3, 1A7, 1A8, 1A9 en 1A10) en een selecte groep SULT-enzymen (SULT1A1, 1A2, 1E1 en 2A1). Wanneer deze enzymen aanwezig waren, daalde de groene fluorescentie en steeg de blauwe fluorescentie.

De onderzoekers maten ook hoe snel deze enzymen werkten. In menselijke levermonsters was de snelheid van glucuronidering (de groen-naar-blauw schakel via UGT's) 5,10 ± 0,14 nmol/(sg prot), terwijl deze in de darm 2,9 ± 0,46 nmol/(sg prot) was. Voor sulfonering (de schakel via SULT's) was de lever-snelheid 0,063 ± 0,026 nmol/(sg prot) en in de darm 0,199 ± 0,007 nmol/(sg prot). Interessant genoeg ontdekten ze dat de lever veel beter is in glucuronidering dan de darm, maar dat de darm daadwerkelijk sneller is in sulfonering.

Een van de meest fascinerende delen van hun ontdekking was hoe de enzymen zich gedroegen. De meeste enzymen volgen een eenvoudige regel: meer voedsel (substraat) betekent meer werk, tot een bepaalde limiet. Echter, het team vond dat de meeste enzymen die op F-pyreen werkten een patroon van "substraatinhibitie" volgden. Stel je een fabrieksarbeider voor die zo overweldigd raakt door een stapel dozen dat hij eroverheen begint te struikelen en daardoor langzamer gaat werken. Dat is wat hier gebeurde: wanneer er te veel F-pyreen was, vertraagden de enzymen zelfs. Alleen één enzym, SULT2A1, volgde de standaard, voorspelbare regels.

Het team controleerde ook of F-pyreen toxisch was voor de cellen. Ze stelden vast dat de cellen gezond en levend bleven bij de concentraties die gebruikt werden voor de experimenten, en vertoonden pas tekenen van stress bij veel hogere doses (boven de 40 µM voor F-pyreen). Dit bevestigde dat F-pyreen een veilige, niet-toxische tool is om deze processen in levende cellen te observeren.

Uiteindelijk concludeerden de auteurs dat F-pyreen een veelzijdige nieuwe tool is. Het is niet alleen een kleurstof; het is een reporter die ons kan vertellen welke cellen actief stoffen metaboliseren en welke enzymen het zware werk doen. Omdat de ongetagde versie groen is en de getagde versies blauw zijn, kunnen onderzoekers het tegelijkertijd gebruiken om transport en metabolisme te visualiseren. Ze suggereerden zelfs dat, omdat verschillende cellen met verschillende snelheden blauw werden, deze tool potentieel gebruikt kan worden om cellen te sorteren op basis van hoe goed ze in staat zijn om chemicaliën te ontgiften. Het is een klein, gloeiend molecuul dat een groot, kleurrijk venster opent naar de verborgen wereld van hoe onze lichamen de schoonmaak uitvoeren.