A cell-permeable pyranine derivative as new fluorescent substrate for human UDP- glucuronosyltransferase and sulfotransferase enzymes

想象一下，你的身体是一座繁忙且戒备森严的城市。每天，它都会面临来自外界的、它无法识别的异物入侵——这些是来自食物、药物和环境中的化学物质。为了确保城市的安全，它拥有一支专门的清理小组。这支小组并不只是把垃圾扔掉，而是给这些入侵者贴上特殊的“标签”，将它们变成水溶性的包裹，以便通过尿液或胆汁轻松排出体外。这个过程被称为代谢，而两个主要的“贴标签员”是名为 UGTs（添加葡萄糖醛酸标签）和 SULTs（添加硫酸根标签）的酶。科学家们长期以来一直想在活细胞内实时观察这种贴标签的过程，但这通常就像是在黑暗中观看魔术师表演：你知道发生了什么，但如果不停止表演并拆解一切，你就无法看到细节。

欢迎来到荧光化学的世界。把荧光染料想象成科学家可以用作点亮生物过程的微型发光萤火虫。如果你能让一只萤火虫在被贴上标签后改变颜色，你就能实时观察清理小组的工作情况。核心问题一直是：我们能否找到一种“智能萤火虫”，它足够小，可以溜进细胞；足够亮，可以被看见；并且足够敏感，能在 UGT 或 Sلت 酶执行任务的一瞬间改变颜色？如果我们能做到这一点，我们不仅能测量清理小组工作的速度，还能实际“看到”哪些细胞在努力工作，哪些在偷懒，而无需破坏细胞。

这正是 Risto O. Juvonen 及其团队致力于讲述的故事。他们发现了一种被称为“F-pyrene”的新型化学物质，它是吡喃酮（pyranine）分子的一种衍生物。把 F-pyrene 想象成一只发着绿光的绿色萤火虫，它既小巧又隐蔽，足以溜进肝细胞（具体来说是一种被称为 HepG2 的人类肝细胞系）的大门。一旦进入内部，魔法就发生了。研究人员观察到，虽然细胞最初闪烁着明亮的、快乐的绿色，但一部分细胞开始发生色彩偏移，变成了冷峻的电蓝色。

团队假设这种颜色变化并非故障，而是工作的迹象。他们怀疑细胞的贴标签酶正在抓取 F-pyrene 并为其附上葡萄糖醛酸或硫酸根标签。就像变色龙改变皮肤一样，F-pyrene 在被贴上标签后，其“光芒”从绿色变成了蓝色。为了证明这一点，他们不仅仅是猜测，而是建立了一系列如同法医调查般的实验。

首先，他们确认了 F-pyrene 确实是一个“具有细胞渗透性”的间谍。当他们将其添加到肝细胞培养物中时，细胞几乎立即吸收了它，在两分钟内变绿。随着时间的推移，一些细胞的绿色光芒开始褪去，取而代之的是蓝色斑点。通过使用一种能将光分解为精确颜色的高功率显微镜，他们证明了发射于 535 nm 的绿光是未贴标签的 F-pyrene，而发射于 460 nm 的蓝光则是被贴标签的版本。这是一个至关重要的发现，因为与许多在代谢后仅仅是变暗的染料不同，F-pyrene 的标签实际上会发出另一种颜色的光。这意味着科学家可以同时观察“之前”和“之后”，就像亲眼看着一个绿球在眼前变成蓝球一样。

接下来，团队想要确切知道哪些酶负责这种色彩变化的魔法。他们针对人类肝脏和肠道中发现的一系列酶对 F-pyrene 进行了测试。他们发现，F-pyrene 是特定一组 UGT 酶（具体包括 UGT1A1, 1A3, 1A7, 1A8, 1A9 和 1A10）和一组精选 SULT 酶（SULT1A1, 1A2, 1E1 和 2A1）的最爱。当这些酶存在时，绿色荧光下降，蓝色荧光上升。

研究人员还测量了这些酶的工作速度。在人类肝脏样本中，葡萄糖醛酸化速率（通过 UGTs 实现的绿转蓝切换）为 5.10 ± 0.14 nmol/(sg prot)，而在肠道中为 2.9 ± 0.46 nmol/(sg prot)。对于硫酸化（通过 SULTs 实现的切换），肝脏速率为 0.063 ± 0.026 nmol/(sg prot)，而肠道速率为 0.199 ± 0.007 nmol/(sg prot)。有趣的是，他们发现肝脏在葡萄糖醛酸化方面比肠道更出色，但肠道在硫酸化方面实际上更快。

他们发现中最迷人的部分之一是这些酶的行为方式。大多数酶遵循一个简单的规则：更多的食物（底物）等于更多的劳动，直到达到一个极限。然而，团队发现大多数作用于 F-pyrene 的酶都遵循“底物抑制”模式。想象一个工厂工人，由于面前堆积如山的箱子太多，以至于他开始被绊倒并工作得越来越慢。这就是这里发生的情况：当 F-pyrene 过多时，酶的工作效率反而下降了。只有一种酶，即 SULT2A1，遵循了标准且可预测的规则。

团队还检查了 F-pyrene 是否对细胞具有毒性。他们发现，在实验使用的浓度下，细胞保持健康和存活，仅在极高剂量（F-pyrene 超过 40 µM）时才表现出压力迹象。这证实了 F-pyrene 是一个安全、无毒的工具，用于观察活细胞中的这些过程。

最后，作者得出结论，F-pyrene 是一个多功能的工具。它不仅仅是一种染料，更是一个可以告诉我们哪些细胞正在积极代谢药物以及哪些酶在承担重任的报告器。由于未贴标签的版本是绿色的，而贴标签的版本是蓝色的，研究人员可以利用它同时可视化运输和代谢过程。他们甚至建议，由于不同细胞变蓝的速度不同，该工具潜在地可以用于根据细胞解毒化学物质的能力进行细胞分类。它是一个微小的、发光的分子，为窥探人体如何“清理房屋”的隐藏世界打开了一扇色彩斑斓的大窗。