A cell-permeable pyranine derivative as new fluorescent substrate for human UDP- glucuronosyltransferase and sulfotransferase enzymes

Imaginez que votre corps est une ville bouillonnante et hautement sécurisée. Chaque jour, elle fait face à un barrage de visiteurs étrangers — des substances chimiques provenant de la nourriture, des médicaments et de l'environnement — qu'elle ne reconnaît pas. Pour garder la ville en sécurité, elle dispose d'une équipe de nettoyage spécialisée. Cette équipe ne se contente pas de jeter les déchets ; elle appose des « étiquettes » spéciales sur ces intrus, les transformant en paquets hydrosolubles qui peuvent être facilement évacués par l'urine ou la bile. Ce processus s'appelle le métabolisme, et les deux principaux étiqueteurs sont des enzymes nommées UGT (qui ajoutent une étiquette d'acide glucuronique) et SULT (qui ajoutent une étiquette de sulfate). Les scientifiques voulaient depuis longtemps observer ce processus d'étiquetage en temps réel à l'intérieur de cellules vivantes, mais c'est généralement comme essayer de regarder le tour d'un magicien dans l'obscurité : vous savez que quelque chose se passe, mais vous ne pouvez pas voir les détails sans arrêter le spectacle et tout démonter.

Entrez dans le monde de la chimie fluorescente. Considérez les colorants fluorescents comme de minuscules lucioles brillantes que les scientifiques peuvent utiliser pour éclairer les processus biologiques. Si vous pouvez faire en sorte qu'une luciole change de couleur lorsqu'on lui attache une étiquette, vous pouvez observer l'équipe de nettoyage travailler en temps réel. La grande question a été : pouvons-nous trouver une « luciole intelligente » assez petite pour se faufiler dans une cellule, assez brillante pour être vue, et assez sensible pour changer de couleur au moment précis où une enzyme UGT ou SULT fait son travail ? Si nous pouvions, nous ne ferions pas seulement mesurer la vitesse à laquelle l'équipe de nettoyage travaille ; nous pourrions réellement voir quelles cellules travaillent dur et lesquelles paressent, le tout sans détruire la cellule.

C'est exactement l'histoire que Risto O. Juvonen et son équipe ont entrepris de raconter. Ils ont découvert une nouvelle substance chimique qu'ils appellent « F-pyrène », un dérivé d'une molécule appelée pyranine. Considérez le F-pyrène comme une luciole verte et brillante, qui est assez petite et furtive pour se glisser directement par la porte d'entrée d'une cellule hépatique (plus précisément, une lignée de cellules de foie humain appelée HepG2). Une fois à l'intérieur, la magie opère. Les chercheurs ont observé que, tandis que la cellule brillait initialement d'un vert vif et joyeux, une fraction des cellules commençait à changer de couleur, devenant d'un bleu électrique et frais.

L'équipe a émis l'hypothèse que ce changement de couleur n'était pas un bug, mais le signe d'un travail en cours. Ils soupçonnaient que les enzymes d'étiquetage de la cellule saisissaient le F-pyrène et lui attachaient soit une étiquette d'acide glucuronique, soit une étiquette de sulfate. Tout comme un caméléon change de peau, le F-pyrène change de « lueur », passant du vert au bleu une fois étiqueté. Pour le prouver, ils ne se sont pas contentés de deviner ; ils ont mis en place une série d'expériences qui agissaient comme une enquête médico-légale.

D'abord, ils ont confirmé que le F-pyrène est bel et bien un espion « perméable aux cellules ». Lorsqu'ils l'ont ajouté à une culture de cellules hépatiques, les cellules l'ont absorbé presque instantanément, devenant vertes en deux minutes. Au fil du temps, la lueur verte dans certaines cellules a commencé à s'estomper, remplacée par des taches bleues. En utilisant un microscope haute puissance capable de séparer la lumière en ses couleurs exactes, ils ont prouvé que la lumière verte (émise à 535 nm) était le F-pyrène non étiqueté, tandis que la lumière bleue (émise à 460 nm) était la version étiquetée. C'était une découverte cruciale car, contrairement à de nombreux autres colorants qui deviennent simplement sombres lorsqu'ils sont métabolisés, les étiquettes du F-pyrène brillent dans une couleur différente. Cela signifie que les scientifiques peuvent observer le « avant » et le « après » simultanément, comme si l'on regardait une balle verte se transformer en une balle bleue sous leurs yeux.

Ensuite, l'équipe a voulu savoir exactement quelles enzymes étaient responsables de cette magie de changement de couleur. Ils ont testé le F-pyrène contre une bibliothèque d'enzymes humaines présentes dans le foie et les intestins. Ils ont découvert que le F-pyrène était le plat préféré d'un groupe spécifique d'enzymes UGT (spécifiquement UGT1A1, 1A3, 1A7, 1A8, 1A9 et 1A10) et d'un groupe sélectionné d'enzymes SULT (SULT1A1, 1A2, 1E1 et 2A1). Lorsque ces enzymes étaient présentes, la fluorescence verte diminuait et la fluorescence bleue augmentait.

Les chercheurs ont également mesuré la vitesse à laquelle ces enzymes travaillaient. Dans des échantillons de foie humain, le taux de glucuronidation (le passage du vert au bleu via les UGT) était de 5,10 ± 0,14 nmol/(sg prot), tandis que dans l'intestin, il était de 2,9 ± 0,46 nmol/(sg prot). Pour la sulfonation (le passage via les SULT), le taux du foie était de 0,063 ± 0,026 nmol/(sg prot) et celui de l'intestin était de 0,199 ± 0,007 nmol/(sg prot). Curieusement, ils ont trouvé que le foie était bien plus performant pour la glucuronidation que l'intestin, mais que l'intestin était en réalité plus rapide pour la sulfonation.

L'un des aspects les plus fascinants de leur découverte était la façon dont les enzymes se comportaient. La plupart des enzymes suivent une règle simple : plus de nourriture (substrat) égale plus de travail, jusqu'à une certaine limite. Cependant, l'équipe a découvert que la plupart des enzymes travaillant sur le F-pyrène suivaient un schéma d'« inhibition par le substrat ». Imaginez un ouvrier d'usine qui, face à une pile de boîtes trop imposante, commence à trébucher dessus et à travailler plus lentement. C'est ce qui s'est passé ici : lorsqu'il y avait trop de F-pyrène, les enzymes ralentissaient réellement. Seule une enzyme, la SULT2A1, suivait les règles standards et prévisibles.

L'équipe a également vérifié si le F-pyrène était toxique pour les cellules. Ils ont constaté que les cellules restaient saines et vivantes aux concentrations utilisées pour les expériences, ne montrant des signes de stress qu'à des doses beaucoup plus élevées (au-dessus de 40 µM pour le F-pyrène). Cela a confirmé que le F-pyrène est un outil sûr et non toxique pour observer ces processus dans des cellules vivantes.

En fin de compte, les auteurs ont conclu que le F-pyrène est un nouvel outil polyvalent. Ce n'est pas seulement un colorant ; c'est un rapporteur qui peut nous dire quelles cellules métabolisent activement les médicaments et quelles enzymes font le plus gros du travail. Parce que la version non étiquetée est verte et que les versions étiquetées sont bleues, les chercheurs peuvent utiliser cet outil pour visualiser simultanément le transport et le métabolisme. Ils ont même suggéré que, puisque différentes cellules devenaient bleues à des rythmes différents, cet outil pourrait potentiellement être utilisé pour trier les cellules en fonction de leur capacité à détoxifier les substances chimiques. C'est une petite molécule brillante qui ouvre une grande fenêtre colorée sur le monde caché de la manière dont nos corps font le ménage.