A cell-permeable pyranine derivative as new fluorescent substrate for human UDP- glucuronosyltransferase and sulfotransferase enzymes

Stellen Sie sich vor, Ihr Körper wäre eine geschäftige, hochgesicherte Stadt. Jeden Tag sieht er sich einer Flut von fremden Besuchern gegenüber – Chemikalien aus Nahrung, Medikamenten und der Umwelt –, die er nicht erkennt. Um die Stadt sicher zu halten, verfügt er über eine spezialisierte Reinigungstruppe. Diese Truppe wirft den Müll nicht einfach nur weg; sie setzt spezielle „Tags“ (Markierungen) an diese Eindringlinge an und verwandelt sie so in wasserlösliche Pakete, die leicht über den Urin oder die Galle ausgeschieden werden können. Dieser Prozess wird als Metabolismus bezeichnet, und die beiden wichtigsten Markierer sind Enzyme namens UGTs (die einen Glucuronsäure-Tag hinzufügen) und SULTs (die einen Sulfat-Tag hinzufügen). Wissenschaftler wollten diesen Markierungsprozess schon lange in Echtzeit in lebenden Zellen beobachten, aber normalerweise ist es so, als würde man versuchen, einen Zaubertrick im Dunkeln zu beobachten: Man weiß, dass etwas passiert, aber man kann die Details nicht sehen, ohne die Show zu stoppen und alles auseinanderzunehmen.

Hier kommt die Welt der fluoreszierenden Chemie ins Spiel. Betrachten Sie fluoreszierende Farbstoffe als winzige, leuchtende Glühwürmchen, die Wissenschaftler nutzen können, um biologische Prozesse zu beleuchten. Wenn man ein Glühwürmchen dazu bringen kann, die Farbe zu ändern, sobald ihm ein Tag angehängt wird, kann man der Reinigungstrupp bei der Arbeit in Echtzeit zusehen. Die große Frage war: Können wir ein „smartes Glühwürmchen“ finden, das klein genug ist, um unbemerkt in eine Zelle zu schlüpfen, hell genug, um gesehen zu werden, und empfindlich genug, um die Farbe in dem Moment zu ändern, in dem ein UGT- oder SULT-Enzym seine Arbeit verrichtet? Wenn uns das gelänge, könnten wir nicht nur messen, wie schnell die Reinigungstrupp arbeitet, sondern wir könnten tatsächlich sehen, welche Zellen hart arbeiten und welche trödeln, und das, ohne die Zelle zu zerstören.

Genau das ist die Geschichte, die Risto O. Juvonen und sein Team erzählen wollten. Sie entdeckten eine neue Chemikalie, die sie „F-Pyren“ nennen, ein Derivat eines Moleküls namens Pyranin. Betrachten Sie F-Pyren als ein leuchtend grünes Glühwürmchen, das klein und hinterlistig genug ist, um direkt durch die Vordertür einer Leberzelle (speziell einer menschlichen Leberzelllinie namens HepG2) zu schlüpfen. Einmal im Inneren, geschieht die Magie. Die Forscher beobachteten, dass, während die Zelle anfangs in einem hellen, fröhlichen Grün leuchtete, ein Teil der Zellen begann, die Farbe zu wechseln und in ein kühles, elektrisches Blau überzuge-gehen.

Das Team stellte die Hypothese auf, dass dieser Farbwechsel kein Fehler war, sondern ein Zeichen für geleistete Arbeit. Sie vermuteten, dass die Markierungsenzyme der Zelle das F-Pyren packten und entweder einen Glucuronsäure- oder einen Sulfat-Tag an es anhängten. Genau wie ein Chamäleon, das seine Haut verändert, änderte das F-Pyren sein „Leuchten“ von Grün nach Blau, sobald es markiert wurde. Um dies zu beweisen, gingen sie nicht nur nach Vermutungen vor; sie gestalteten eine Reihe von Experimenten, die wie eine forensische Untersuchung funktionierten.

Zuerst bestätigten sie, dass F-Pyren in der Tat ein „zellpermeabler“ Spion ist. Als sie es einer Kultur von Leberzellen hinzufügten, verschlangen die Zellen es fast augenblicklich und wurden innerhalb von zwei Minuten grün. Mit fortschreitender Zeit begann das grüne Leuchten in einigen Zellen zu verblassen und wurde durch blaue Punkte ersetzt. Durch die Verwendung eines Hochleistungsmikroskops, das Licht in seine exakten Farben trennen konnte, bewiesen sie, dass das grüne Licht (emittiert bei 535 nm) das unmarkierte F-Pyren war, während das blaue Licht (emittiert bei 460 nm) die markierte Version darstellte. Dies war eine entscheidende Entdeckung, denn im Gegensatz zu vielen anderen Farbstoffen, die während ihres Metabolismus einfach dunkel werden, leuchten die Tags von F-Pyren tatsächlich in einer anderen Farbe. Das bedeutet, Wissenschaftler können das „Davor“ und das „Danach“ gleichzeitig beobachten, so als würde man beobachten, wie ein grüner Ball direkt vor den eigenen Augen zu einem blauen Ball wird.

Als Nächstes wollte das Team genau wissen, welche Enzyme für diese farbverändernde Magie verantwortlich waren. Sie testeten F-Pyren gegen eine Bibliothek menschlicher Enzyme, die in der Leber und im Darm vorkommen. Sie fanden heraus, dass F-Pyren ein Lieblingssnack für eine spezifische Gruppe von UGT-Enzymen (speziell UGT1A1, 1A3, 1A7, 1A8, 1A9 und 1A10) und eine ausgewählte Gruppe von SULT-Enzymen (SULT1A1, 1A2, 1E1 und 2A1) war. Wenn diese Enzyme vorhanden waren, sank die grüne Fluoreszenz und die blaue Fluoreszenz stieg an.

Die Forscher maßen auch, wie schnell diese Enzyme arbeiteten. In menschlichen Leberproben lag die Rate der Glucuronidierung (der Wechsel von Grün zu Blau via UGTs) bei 5,10 ± 0,14 nmol/(sg Prot), während sie im Darm bei 2,9 ± 0,46 nmol/(sg Prot) lag. Für die Sulfonierung (den Wechsel via SULTs) betrug die Leberrate 0,063 ± 0,026 nmol/(sg Prot) und die Darmrate 0,199 ± 0,007 nmol/(sg Prot). Interessanterweise fanden sie heraus, dass die Leber wesentlich besser in der Glucuronidierung war als der Darm, der Darm jedoch tatsächlich schneller in der Sulfonierung war.

Einer der faszinierendsten Teile ihrer Entdeckung war, wie sich die Enzyme verhielten. Die meisten Enzyme folgen einer einfachen Regel: Mehr Nahrung (Substrat) bedeutet mehr Arbeit, bis zu einem gewissen Limit. Hier jedoch stellten die Forscher fest, dass die meisten an F-Pyren arbeitenden Enzyme einem Muster der „Substrat-Inhibition“ folgten. Stellen Sie sich einen Fabrikarbeiter vor, der von einem Haufen Kartons so überwältigt wird, dass er anfängt, darüber zu stolpern und dadurch langsamer arbeitet. Genau das passierte hier: Wenn zu viel F-Pyren vorhanden war, verlangsamten sich die Enzyme tatsächlich. Nur ein Enzym, SULT2A1, folgte den Standard-, vorhersehbaren Regeln.

Das Team überprüfte auch, ob F-Pyren toxisch für die Zellen war. Sie fanden heraus, dass die Zellen bei den für die Experimente verwendeten Konzentrationen gesund und am Leben blieben und erst bei viel höheren Dosen (über 40 µM für F-Pyren) Anzeichen von Stress zeigten. Dies bestätigte, dass F-Pyren ein sicheres, nicht-toxisches Werkzeug zur Beobachtung dieser Prozesse in lebenden Zellen ist.

Abschließend kamen die Autoren zu dem Schluss, dass F-Pyren ein vielseitiges neues Werkzeug ist. Es ist nicht nur ein Farbstoff; es ist ein Reporter, der uns sagen kann, welche Zellen aktiv Medikamente metabolisieren und welche Enzyme die Hauptarbeit leisten. Da die unmarkierte Version grün und die markierten Versionen blau sind, können Forscher es verwenden, um Transport und Metabolismus gleichzeitig zu visualisieren. Sie deuteten sogar an, dass dieses Werkzeug potenziell dazu verwendet werden könnte, Zellen basierend darauf zu sortieren, wie gut sie in der Lage sind, Chemikalien zu entgiften, da sich verschiedene Zellen unterschiedlich schnell blau färbten. Es ist ein kleines, leuchtendes Molekül, das ein großes, farbenfrohes Fenster in die verborgene Welt eröffnet, wie unser Körper das Haus reinigt.