A cell-permeable pyranine derivative as new fluorescent substrate for human UDP- glucuronosyltransferase and sulfotransferase enzymes

Imagine que o seu corpo é uma cidade movimentada e de alta segurança. Todos os dias, ele enfrenta uma barragem de visitantes estrangeiros — produtos químicos de alimentos, medicamentos e do ambiente — que ele não reconhece. Para manter a cidade segura, ele possui uma equipe de limpeza especializada. Esta equipe não apenas joga o lixo fora; eles anexam "etiquetas" especiais a esses intrusos, transformando-os em pacotes solúveis em água que podem ser facilmente lavados na urina ou na bile. Esse processo é chamado de metabolismo, e os dois principais etiquetadores são enzimas chamadas UGTs (que adicionam uma etiqueta de ácido glucurônico) e SULTs (que adicionam uma etiqueta de sulfato). Os cientistas há muito tempo queriam observar esse processo de etiquetagem acontecendo em tempo real dentro de células vivas, mas geralmente é como tentar assistir ao truque de um mágico no escuro: você sabe que algo está acontecendo, mas não consegue ver os detalhes sem interromper o espetáculo e desmontar tudo.

Entre no mundo da química fluorescente. Pense nos corantes fluorescentes como pequenos vaga-lumes brilhantes que os cientistas podem usar para iluminar processos biológicos. Se você conseguir fazer um vaga-lume mudar de cor quando recebe uma etiqueta anexada, você pode observar a equipe de limpeza trabalhando em tempo real. A grande questão tem sido: Podemos encontrar um "vaga-lume inteligente" que seja pequeno o suficiente para se infiltrar em uma célula, brilhante o suficiente para ser visto e sensível o suficiente para mudar de cor no momento em que uma enzima UGT ou SULT faz o seu trabalho? Se conseguíssemos, não apenas poderíamos medir o quão rápido a equipe de limpeza trabalha; poderíamos realmente ver quais células estão trabalhando duro e quais estão relaxando, tudo isso sem destruir a célula.

Esta é exatamente a história que Risto O. Juvonen e sua equipe se propuseram a contar. Eles descobriram um novo composto químico que chamam de "F-pirene", um derivado de uma molécula chamada piranina. Pense no F-pirene como um vaga-lume verde brilhante que é pequeno e astuto o suficiente para deslizar pela porta da frente de uma célula do fígado (especificamente, uma linhagem de células hepáticas humanas chamada HepG2). Uma vez dentro, a mágica acontece. Os pesquisadores observaram que, enquanto a célula inicialmente brilhava com um verde vivo e feliz, uma fração das células começou a mudar de cor, tornando-se um azul elétrico e refrescante.

A equipe hipotetizou que essa mudança de cor não era um erro, mas um sinal de que o trabalho estava sendo feito. Eles suspeitaram que as enzimas de etiquetagem da célula estavam agarrando o F-pirene e anexando a ele uma etiqueta de ácido glucurônico ou de sulfato. Assim como um camaleão mudando sua pele, o F-pirene mudou seu "brilho" de verde para azul assim que foi etiquetado. Para provar isso, eles não apenas adivinharam; eles montaram uma série de experimentos que atuaram como uma investigação forense.

Primeiro, eles confirmaram que o F-pirene é, de fato, um espião "permeável à célula". Quando adicionaram o composto a uma cultura de células hepáticas, as células o devoraram quase instantaneamente, tornando-se verdes em dois minutos. À medida que o tempo passava, o brilho verde em algumas células começava a desaparecer, substituído por pontos azuis. Ao usar um microscópio de alta potência que podia separar a luz em suas cores exatas, eles provaram que a luz verde (emitida em 535 nm) era o F-pirene não etiquetado, enquanto a luz azul (emitida em 460 nm) era a versão etiquetada. Esta foi uma descoberta crucial porque, ao contrário de muitos outros corantes que simplesmente ficam escuros quando são metabolizados, as etiquetas do F-pirene na verdade brilham em uma cor diferente. Isso significa que os cientistas podem observar o "antes" e o "depois" simultaneamente, como observar uma bola verde se transformando em uma bola azul bem diante de seus olhos.

Em seguida, a equipe queria saber exatamente quais enzimas eram responsáveis por essa mágica de mudança de cor. Eles testaram o F-pirene contra uma biblioteca de enzimas humanas encontradas no fígado e no intestino. Eles descobriram que o F-pirene era o lanche favorito de um grupo específico de enzimas UGT (especificamente UGT1A1, 1A3, 1A7, 1A8, 1A9 e 1A10) e um grupo selecionado de enzimas SULT (SULT1A1, 1A2, 1E1 e 2A1). Quando essas enzimas estavam presentes, a fluorescência verde caía e a fluorescência azul subia.

Os pesquisadores também mediram a rapidez com que essas enzimas trabalhavam. Em amostras de fígado humano, a taxa de glucuronidação (a troca do verde para o azul via UGTs) foi de 5,10 ± 0,14 nmol/(sg prot), enquanto no intestino foi de 2,9 ± 0,46 nmol/(sg prot). Para a sulfonação (a troca via SULTs), a taxa no fígado foi de 0,063 ± 0,026 nmol/(sg prot) e no intestino foi de 0,199 ± 0,007 nmol/(sg prot). Curiosamente, eles descobriram que o fígado era muito melhor em glucuronidação do que o intestino, mas o intestino era, na verdade, mais rápido na sulfonação.

Uma das partes mais fascinantes de sua descoberta foi como as enzimas se comportavam. A maioria das enzimas segue uma regra simples: mais comida (substrato) é igual a mais trabalho, até um certo limite. No entanto, a equipe descobriu que a maioria das enzimas que trabalhavam no F-pirene seguia um padrão de "inibição pelo substrato". Imagine um trabalhador de fábrica que fica tão sobrecarregado por uma pilha de caixas que começa a tropeçar nelas e trabalhar mais devagar. Foi o que aconteceu aqui: quando havia muito F-pirene, as enzimas na verdade diminuíam o ritmo. Apenas uma enzima, SULT2A1, seguiu as regras padrão e previsíveis.

A equipe também verificou se o F-pirene era tóxico para as células. Eles descobriram que as células permaneceram saudáveis e vivas nas concentrações usadas para os experimentos, mostrando sinais de estresse apenas em doses muito mais altas (acima de 40 µM para o F-pirene). Isso confirmou que o F-pirene é uma ferramenta segura e não tóxica para observar esses processos em células vivas.

Ao final, os autores concluíram que o F-pirene é uma nova ferramenta versátil. Ele não é apenas um corante; é um repórter que pode nos dizer quais células estão metabolizando drogas ativamente e quais enzimas estão fazendo o trabalho pesado. Como a versão não etiquetada é verde e as versões etiquetadas são azuis, os pesquisadores podem usar o composto para visualizar o transporte e o metabolismo simultaneamente. Eles até sugeriram que, como diferentes células tornaram-se azuis em taxas diferentes, esta ferramenta poderia potencialmente ser usada para classificar células com base em quão boas elas são em desintoxicar substâncias químicas. É uma pequena molécula brilhante que abre uma janela grande e colorida para o mundo oculto de como nossos corpos fazem a limpeza de casa.