A cell-permeable pyranine derivative as new fluorescent substrate for human UDP- glucuronosyltransferase and sulfotransferase enzymes

あなたの体が高いセキュリティを備えた、活気ある都市であると想像してみてください。毎日、体は食べ物、薬、環境からの化学物質といった、認識できない外来の訪問者の猛攻にさらされています。この都市の安全を守るために、特別な清掃クルーが存在します。このクルーは単にゴミを投げ捨てるのではなく、これらの侵入者に特別な「タグ」を取り付け、それらを水溶性のパッケージに変えて、尿や胆汁で簡単に洗い流せるようにします。このプロセスは代謝と呼ばれ、2つの主要なタグ付け役は、グルクロン酸タグを付加するUGTと、硫酸タグを付加するSULTという名前の酵素です。科学者たちは長い間、生きた細胞の中でこのタグ付けのプロセスが起きている様子をリアルタイムで観察したいと考えてきましたが、それは通常、手品を暗闇の中で見ようとするようなものでした。何かが起きていることは分かっていますが、ショーを止めてすべてを分解しない限り、その詳細を見ることはできません。

ここで、蛍光化学の世界が登場します。蛍光色素を、科学者が生物学的プロセスを照らすために使用できる、小さな光るホタルだと考えてください。もし、タグが付いた瞬間に色が変わるホタルを作ることができれば、清掃クルーが働く様子をリアルタイムで観察することができます。大きな疑問は、「細胞に忍び込むのに十分小さく、目に見えるほど明るく、そしてUGTやSULT酵素が仕事をした瞬間に色を変えるほど敏感な『スマートなホタル』を見つけられるか？」ということでした。もしそれが実現すれば、清掃クルーがどれくらいの速さで働いているかを測定できるだけでなく、細胞を破壊することなく、どの細胞が懸命に働き、どの細胞が怠けているのかを実際に「見る」ことができるのです。

これこそが、リスト・O・ユヴォネンとそのチームが語ろうとした物語です。彼らは、「F-pyrene」と呼ぶ新しい化学物質を発見しました。これはピラニンと呼ばれる分子の誘導体です。F-pyreneを、小さくて巧妙に肝細胞（具体的には、HepG2と呼ばれるヒト肝細胞株）の正面玄関を通り抜けることができる、小さな光る緑色のホタルだと考えてください。細胞内に入ると、魔法が起こります。研究者たちは、細胞が最初は明るく幸せな緑色に輝いていた一方で、細胞の一部が色が変化し、クールでエレクトリックなブルーへと変化していく様子を観察しました。

チームは、この色の変化は不具合ではなく、仕事が行われている兆候であるという仮説を立てました。彼らは、細胞のタグ付け酵素がF-pyreneを掴み、グルクロン酸または硫酸のタグを付加しているのではないかと疑いました。カメレオンが皮膚の色を変えるのと同じように、F-pyreneはタグ付けされると、その「輝き」を緑から青へと変えたのです。これを証明するために、彼らは単に推測するのではなく、フォレンジック調査のような一連の実験を行いました。

まず、彼らはF-pyreneが本当に「細胞透過性」のあるスパイであることを確認しました。培養された肝細胞にF-pyreneを加えると、細胞はほぼ瞬時にそれを飲み込み、2分以内に緑色に変化しました。時間が経過するにつれ、一部の細胞で緑色の輝きが消え始め、代わりに青いスポットが現れました。光を正確な色に分離できる高倍率の顕微鏡を使用することで、彼らは、緑色の光（535 nmで放出）がタグなしのF-pyreneであり、青色の光（460 nmで放出）がタグ付きのバージョンであることを証明しました。これは極めて重要な発見でした。なぜなら、代謝されると単に暗くなる他の多くの色素とは異 달리、F-pyreneのタグは実際に別の色で「光る」からです。これは、科学者が「前」と「後」を同時に観察できることを意味します。まるで、目の前で緑色のボールが青いボールに変わる様子を見ているかのようです。

次に、チームはどの酵素がこの色の変化する魔法の責任者であるのかを正確に知りたかったのです。彼らは、ヒトの肝臓や腸で見られるヒト酵素のライブラリに対してF-pyreneをテストしました。その結果、F-pyreneは特定のグループのUG_T酵素（具体的にはUGT1A1, 1A3, 1A7, 1A8, 1A9, 1A10）と、選ばれたグループのSULT酵素（SULT1A1, 1A2, 1E1, 2A1）にとって好物の軽食であることが分かりました。これらの酵素が存在すると、緑色の蛍光が低下し、青色の蛍光が上昇しました。

研究者たちはまた、これらの酵素がどれくらいの速さで働くかも測定しました。ヒトの肝臓サンプルでは、グルクロン酸抱合の速度（UGTによる緑から青への切り替え）は5.10 ± 0.14 nmol/(sg prot)であり、腸では2.9 ± 0.46 nmol/(sg prot)でした。スルホン化（SULTによる切り替え）については、肝臓の速度は0.063 ± 0.026 nmol/(sg prot)であり、腸の速度は0.199 ± 0.007 nmol/(sg prot)でした。興味深いことに、肝臓は腸よりもグルクロン酸抱合に優れており、一方で腸はスルホン化において実際にはより速いことが分かりました。

彼らの発見の中で最も魅力的な部分の一つは、酵素がどのように振る舞うかでした。ほとんどの酵素は単純なルールに従います：食べ物（基質）が増えれば仕事も増えますが、限界があります。しかし、チームはF-pyreneに対して働くほとんどの酵素が、「基質阻害」のパターンに従っていることを発見しました。工場労働者が、箱の山に圧倒されて、つまずいたり作業が遅くなったりする様子を想像してください。ここで起きていたのはまさにそれでした。F-pyreneが多すぎると、酵素は実際に速度を落としてしまったのです。SULT2A1という一つの酵素だけが、標準的で予測可能なルールに従っていました。

チームはまた、F-pyreneが細胞に対して毒性を持つかどうかも確認しました。彼らは、実験で使用された濃度の範囲内では細胞は健康で生存し続けていることを見出し、はるかに高い濃度（F-pyreneで40 µM以上）でのみストレスの兆候が見られることを発見しました。これにより、F-pyreneが、生きている細胞の中でこれらのプロセスを観察するための、安全で非毒性のツールであることが確認されました。

最終的に、著者らはF-pyreneが多才な新しいツールであると結論付けました。それは単なる色素ではありません。どの細胞が薬物を代謝しているか、どの酵素が重労働をしているかを教えてくれるレポーターなのです。タグなしのバージョンが緑色で、タグ付きのバージョンが青色であるため、研究者は輸送と代謝を同時に可視化することができます。彼らはまた、細胞によって青くなる速度が異なることから、このツールが、化学物質を解毒する能力に基づいて細胞を分類するために利用できる可能性があることも示唆しました。それは、私たちの体がどのように家の中を掃除しているかという、隠された世界への窓を開く、小さく光る分子なのです。