A cell-permeable pyranine derivative as new fluorescent substrate for human UDP- glucuronosyltransferase and sulfotransferase enzymes

Immaginate che il vostro corpo sia una città frenetica e ad alta sicurezza. Ogni giorno affronta un bombardamento di visitatori stranieri — sostanze chimiche provenienti dal cibo, dai medicinali e dall'ambiente — che non riconosce. Per mantenere la città al sicuro, dispone di una squadra di pulizia specializzata. Questa squadra non si limita a buttare via la spazzatura; attacca speciali "etichette" a questi intrusi, trasformandoli in pacchetti idrosolubili che possono essere facilmente lavati via attraverso l'urina o la bile. Questo processo è chiamato metabolismo, e i due principali applicatori di etichette sono enzimi chiamati UGT (che aggiungono un'etichetta di acido glucuronico) e SULT (che aggiungono un'etichetta di solfato). Gli scienziati hanno a lungo desiderato osservare questo processo di etichettatura in tempo reale all'interno delle cellule viventi, ma di solito è come cercare di guardare il trucco di un mago al buio: sapete che sta succedendo qualcosa, ma non potete vedere i dettagli senza fermare lo spettacolo e smontare tutto.

Entrate nel mondo della chimica fluorescente. Pensate ai coloranti fluorescenti come a piccole lucciole luminose che gli scienziati possono usare per illuminare i processi biologici. Se riuscite a far cambiare colore a una lucciola quando le viene attaccata un'etichetta, potete guardare la squadra di pulizia lavorare in tempo reale. La grande domanda è stata: possiamo trovare una "lucciola intelligente" che sia abbastanza piccola da infiltrarsi in una cellula, abbastanza luminosa da essere vista e abbastanza sensibile da cambiare colore nel momento esatto in cui un enzima UGT o SULT compie il suo lavoro? Se ci riuscissimo, non potremmo solo misurare quanto velocemente lavora la squadra di pulizia; potremmo effettivamente vedere quali cellule stanno lavorando sodo e quali stanno pigreggiando, il tutto senza distruggere la cellula.

Questa è esattamente la storia che Risto O. Juvonen e il suo team hanno cercato di raccontare. Hanno scoperto una nuova sostanza chimica che chiamano "F-pirene", un derivato di una molecola chiamata piranina. Pensate all'F-pirene come a una lucciola verde brillante, piccola e furtiva, capace di scivolare proprio attraverso la porta principale di una cella epatica (specificamente, una linea cellulare di cellule del fegato umano chiamata HepG2). Una volta all'interno, avviene la magia. I ricercatori hanno osservato che, mentre la cellula inizialmente brillava di un verde felice e luminoso, una frazione delle cellule ha iniziato a cambiare colore, diventando di un blu fresco ed elettrico.

Il team ha ipotizzato che questo cambio di colore non fosse un errore, ma il segno di un lavoro in corso. Sospettavano che gli enzimi di etichettatura della cellula stessero prendendo l'F-pirene e attaccandovi un'etichetta di acido glucuronico o di solfato. Proprio come un camaleonte che cambia la sua pelle, l'F-pirene ha cambiato il suo "bagliore" da verde a blu una volta etichettato. Per provarlo, non si sono limitati a indovinare; hanno allestito una serie di esperimenti che agivano come un'indagine forense.

Per prima cosa, hanno confermato che l'F-pirene è effettivamente una spia "cellula-permeabile". Quando l'hanno aggiunta a una coltura di cellule epatiche, le cellule l'hanno divorata quasi istantaneamente, diventando verdi entro due minuti. Con il passare del tempo, il bagliore verde in alcune cellule ha iniziato a svanire, sostituito da macchie blu. Usando un microscopio ad alta potenza capace di separare la luce nei suoi colori esatti, hanno dimostrato che la luce verde (emessa a 535 nm) era l'F-pirene non etichettato, mentre la luce blu (emessa a 460 nm) era la versione etichettata. Questa è stata una scoperta cruciale perché, a differenza di molti altri coloranti che semplicemente si spengono quando vengono metabolizzati, le etichette dell'F-pirene brillano di un colore diverso. Ciò significa che gli scienziati possono osservare il "prima" e il "dopo" simultaneamente, come guardare una pallina verde che diventa una pallina blu proprio davanti ai propri occhi.

Successivamente, il team voleva sapere esattamente quali enzimi fossero responsabili di questa magia del cambio di colore. Hanno testato l'F-pirene contro una libreria di enzimi umani presenti nel fegato e nell'intestino. Hanno scoperto che l'F-pirene è uno spuntino preferito da un gruppo specifico di enzimi UGT (specificamente UGT1A1, 1A3, 1A7, 1A8, 1A9 e 1A10) e da un gruppo selezionato di enzimi SULT (SULT1A1, 1A2, 1E1 e 2A1). Quando questi enzimi erano presenti, la fluorescenza verde diminuiva e quella blu aumentava.

I ricercatori hanno anche misurato la velocità con cui questi enzimi lavorano. In campioni di fegato umano, il tasso di glucuronidazione (lo switch dal verde al blu tramite gli UGT) era di 5,10 ± 0,14 nmol/(sg prot), mentre nell'intestino era di 2, 2,9 ± 0,46 nmol/(sg prot). Per la sulfonazione (lo switch tramite i SULT), il tasso nel fegato era di 0,063 ± 0,026 nmol/(sg prot) e nell'intestino era di 0,199 ± 0,007 nmol/(sg prot). Interessante è che hanno scoperto che il fegato era molto più bravo nella glucuronidazione rispetto all'intestino, ma l'intestino era in realtà più veloce nella sulfonazione.

Una delle parti più affascinanti della loro scoperta è stato il modo in cui si comportavano gli enzimi. La maggior parte degli enzimi segue una regola semplice: più cibo (substrato) equivale a più lavoro, fino a un certo limite. Tuttavia, il team ha scoperto che la maggior parte degli enzimi che lavorano sull'F-pirene seguiva un modello di "inibizione da substrato". Immaginate un operaio di fabbrica che, preso da troppe scatole, inizia a inciamparvi sopra e a lavorare più lentamente. È quello che è successo qui: quando c'era troppo F-pirene, gli enzimi rallentavano effettivamente. Solo un enzima, SULT2A1, seguiva le regole standard e prevedibili.

Il team ha anche controllato se l'F-pirene fosse tossico per le cellule. Hanno scoperto che le cellule rimanevano sane e vive alle concentrazioni utilizzate per gli esperimenti, mostrando segni di stress solo a dosi molto più elevate (sopra i 40 µM per l'F-pirene). Ciò ha confermato che l'F-pirene è uno strumento sicuro e non tossico per osservare questi processi nelle cellule viventi.

In conclusione, gli autori hanno affermato che l'F-pirene è un nuovo strumento versatile. Non è solo un colorante; è un reporter che può dirci quali cellule stanno metabolizzando attivamente i farmaci e quali enzimi stanno facendo il lavoro pesante. Poiché la versione non etichettata è verde e le versioni etichettate sono blu, i ricercatori possono usarlo per visualizzare contemporaneamente trasporto e metabolismo. Hanno persino suggerito che, poiché diverse cellule diventavano blu a ritmi differenti, questo strumento potrebbe potenzialmente essere usato per classificare le cellule in base alla loro capacità di disintossicare le sostanze chimiche. È una piccola molecola luminosa che apre una grande, colorata finestra sul mondo nascosto di come i nostri corpi fanno le pulizie di casa.