Linezolid phenotypic resistance in Mycobacterium tuberculosis due to presence of non-tuberculous mycobacteria:a case report

Sintesi Tecnica: Resistenza Fenotipica alla Linezolid in Mycobacterium tuberculosis dovuta a Micobatteri Non Tubercolari

Definizione del Problema
La discordanza tra il test di suscettibilità ai farmaci fenotipico (pDST) e quello genotipico (gDST) complica il processo decisionale clinico per la tubercolosi resistente alla rifampicina (RR-TB). Sebbene il gDST (tramite sequenziamento dell'intero genoma, WGS) sia sempre più utilizzato, può produrre risultati falsi-negativi se i meccanismi di resistenza sono sconosciuti o se le sottopopolazioni resistenti sono al di sotto delle soglie di rilevamento. Al contrario, il pDST può produrre risultati falsi-positivi a causa di sfide tecniche o della presenza di infezioni miste. Questo rapporto di casi investiga un caso specifico di discordanza della linezolid dove il pDST indicava resistenza, ma il WGS non ha rilevato mutazioni conferenti resistenza nei geni rrl o rplc di Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Gli autori hanno ipotizzato che questa discordanza fosse causata da contaminazione o infezione mista con un micobatterio non tubercolare (NTM), dato che la linezolid bersaglia il DNA ribosomiale, un meccanismo altamente conservato tra le diverse specie batteriche.

Metodologia
Lo studio si concentra su un paziente maschio di 48 anni in Sudafrica con una storia di molteplici episodi di RR-TB, diagnosticato con un nuovo episodio nel 2025. L'indagine ha impiegato un approccio multimodale per risolvere la discordanza iniziale tra pDST/gDST:

• Test Iniziali: Gli isolati basali sono stati sottoposti a pDST (BACTEC MGIT960) e WGS basato su Illumina. È stato eseguito anche un saggio a sonda lineare (line probe assay).
• Sequenziamento Profondo e Profilazione: Per investigare la discordanza, gli autori hanno utilizzato:
  • NTM-Profiler (v0.8.2): Applicato ai dati WGS basali per identificare le specie e le abbondanze relative.
  • Allineamento Genomico: Allineamento dei geni rrl e rplc tra Mtb (riferimento H37Rv) e gli ceppi di NTM identificati (ad es., M. sinense JDM601) per valutare la conservazione delle posizioni associate alla resistenza.
  • Saggi della Concentrazione Minima Inibitoria (MIC): Eseguiti sull'isolato basale e su specifici tubi contenenti il farmaco.
  • NGS Mirato (tNGS): Il saggio Deeplex MycMTB è stato applicato al tubo del pDST contenente linezolid.
  • WGS di Subcoltura: Il WGS è stato eseguito sulle subcolture dell'isolato basale e su specifici tubi di controllo della crescita/contenenti il farmaco per determinare la composizione delle specie in presenza del farmaco.
• Follow-up: L'isolato del secondo mese del paziente è stato sottoposto a Xpert MTB/XDR, WGS ed esteso pDST per monitorare la risposta al trattamento e l'emergere della resistenza.

Risultati Chiave

• Discordanza Iniziale: L'isolato basale ha mostrato resistenza fenotipica alla linezolid (MIC ≥ 1 mg/L) ma suscettibilità genotipica (nessuna variante in rrl o rplc).
• Identificazione di Infezione Mista:
  • L'analisi NTM-Profiler dei dati WGS basali ha rivelato un'infezione mista: 34,6% M. tuberculosis e 65,4% Mycobacterium sinense.
  • L'allineamento genomico ha confermato che M. sinense possiede un'alta identità (84% per rplc, 91% per rrl) con Mtb nelle sette posizioni associate alla resistenza alla linezolid, spiegando perché l'NTM apparirebbe resistente in un saggio fenotipico.
• Meccanismo di Falsa Resistenza:
  • Il WGS del tubo di controllo della crescita ha confermato la presenza di entrambe le specie.
  • Fondamentalmente, il WGS dei tubi MGIT contenenti linezolid (0,5 e 2,0 mg/L) ha rilevato solo M. sinense, senza alcun rilevamento di M. tuberculosis.
  • Ciò ha confermato che il ceppo di M. tuberculosis era suscettibile (non è cresciuto in presenza di linezolid), mentre il ceppo di M. sinense era resistente e cresceva, portando il pDST a segnalare erroneamente l'isolato di Mtb come resistente.
  • Il tNGS (Deeplex MycMTB) sul tubo del farmaco ha rilevato M. kumamotonense, ma l'allineamento genomico ha suggerito che il contaminante reale fosse M. sinense, evidenziando i limiti dei metodi di identificazione a singolo marcatore.
• Decorso Clinico: Il paziente ha inizialmente ricevuto un regime BPaL-L. A causa dell'incertezza sulla suscettibilità alla linezolid e della positività della coltura al secondo mese, è stato raccomandato un complesso regime a 9 farmaci. Il paziente ha infine ottenuto la conversione della coltura. Gli isolati del secondo mese hanno confermato la suscettibilità di Mtb alla linezolid ma hanno rivelato una resistenza emergente a bedaquilina e clofazimina.

Significatività e Rivendicazioni
L'articolo sostiene di riportare il primo caso di discordanza pDST-gDST per la linezolid in cui la resistenza fenotipica è stata causata dalla presenza di un NTM a crescita lenta (M. sinense) piuttosto che da un risultato genotipico falso-negativo o da un fallimento tecnico del WGS.

Gli autori sostengono che questo reperto mette in discussione l'assunto prevalente secondo cui la discordanza della linezolid è dovuta principalmente all'incapacità del NGS di rilevare le mutazioni di resistenza. Inveve, pongono l'ipotesi che la presenza di NTM nella coltura possa portare a risultati pDST falsamente resistenti. Lo studio conclude che quando i risultati di sequenziamento non rilevano una mutazione conferente resistenza, la presenza di un NTM dovrebbe essere indagata tramite esame macroscopico e colorazione di Ziehl-Neelsen prima di riferire un risultato di Mtb resistente alla linezolid. Gli autori suggeriscono che comprendere la frequenza di questo fenomeno è essenziale per valutare accuratamente la reale sensibilità del NGS per la rilevazione della resistenza alla linezolid.