Linezolid phenotypic resistance in Mycobacterium tuberculosis due to presence of non-tuberculous mycobacteria:a case report

Technisches Resümee: Phänotypische Linezolid-Resistenz bei Mycobacterium tuberculosis aufgrund von nicht-tuberkulösen Mykobakterien

Problemstellung
Die Diskrepanz zwischen phänotypischen Arzneimittelresistenztests (pDST) und genotypischen Arzneimittelresistenztests (gDST) erschwert die klinische Entscheidungsfindung bei rifampicin-resistenter Tuberkulose (RR-TB). Während gDST (mittels Ganzgenomsequenzierung, WGS) zunehmend eingesetzt wird, kann es zu falsch-negativen Ergebnissen kommen, wenn Resistenzmechanismen unbekannt sind oder resistente Subpopulationen unterhalb der Detektionsschwelle liegen. Umgekehrt können pDST aufgrund technischer Herausforderungen oder des Vorhandenseins von Mischinfektionen falsch-positive Ergebnisse liefern. Dieser Fallbericht untersucht einen spezifischen Fall von Linezolid-Diskordanz, bei dem das pDST eine Resistenz anzeigte, die WGS jedoch keine resistenzverursachenden Mutationen in den Genen rrl oder rplC von Mycobacterium tuberculosis (Mtb) nachwies. Die Autoren hypothetisierten, dass diese Diskordanz durch eine Kontamination oder eine Mischinfektion mit einem nicht-tuberkulösen Mykobakterium (NTM) verursacht wurde, da Linezolid auf die ribosomale DNA abzielt, einen hochkonservierten Mechanismus über verschiedene Bakterienarten hinweg.

Methodik
Die Studie konzentriert sich auf einen 48-jährigen männlichen Patienten aus Südafrika mit einer Anamnese multipler RR-TB-Episoden, bei dem 2025 eine neue Episode diagnostiziert wurde. Die Untersuchung nutzte einen multimodalen Ansatz, um die anfängliche pDST/gDST-Diskordanz aufzuklären:

• Initialtests: Die Basis-Isolate wurden einem pDST (BACTEC MG1960) und einer Illumina-basierten WGS unterzogen. Ein Line-Probe-Assay wurde ebenfalls durchgeführt.
• Tiefensequenzierung und Profiling: Um die Diskordanz zu untersuchen, verwendeten die Autoren:
  • NTM-Profiler (v0.8.2): Angewendet auf die Basis-WGS-Daten zur Identifizierung von Spezies und relativen Häufigkeiten.
  • Genomische Alignment: Abgleich der rrl- und rplc-Gene zwischen Mtb (H37Rv-Referenz) und identifizierten NTM-Stämmen (z. B. M. sinense JDM601), um die Konservierung von resistenzassoziierten Positionen zu bewerten.
  • Minimale Hemmkonzentrations-Assays (MIC): Durchgeführt am Basis-Isolat und spezifischen drogenhaltigen MGIT-Röhren.
  • Targeted NGS (tNGS): Der Deeplex MycMTB-Assay wurde auf die linezolidhaltige pDST-Röhre angewendet.
• Subkultur-WGS: WGS wurde an Subkulturen des Basis-Isolats und spezifischen Wachstums- bzw. drogenhaltigen Röhren durchgeführt, um die Spezieszusammensetzung in Gegenwart des Medikaments zu bestimmen.
• Follow-up: Das Kultur-Isolat des zweiten Monats des Patienten wurde Xpert MTB/XDR, WGS und einem erweiterten pDST unterzogen, um das Ansprechen auf die Behandlung und entstehende Resistenzen zu überwachen.

Wichtigste Ergebnisse

• Anfängliche Diskordanz: Das Basis-Isolat zeigte eine phänotypische Resistenz gegen Linezolid (MIC ≥ 1 mg/L), aber eine genotypische Suszeptibilität (keine Varianten in rrl oder rplc).
• Identifizierung einer Mischinfektion:
  • Die NTM-Profiler-Analyse der Basis-WGS-Daten enthüllte eine Mischinfektion: 34,6 % Mycobacterium tuberculosis und 65,4 % Mycobacterium sinense.
  • Das genomische Alignment bestätigte, dass M. sinense eine hohe Identität (84 % für rplc, 91 % für rrl) mit Mtb an den sieben mit Linezolid-Resistenz assoziierten Positionen aufweist, was erklärt, warum das NTM in einem phänotypischen Assay als resistent erscheinen würde.
• Mechanismus der Scheinresistenz:
  • Die WGS der Wachstums-Kontrollröhre bestätigte die Anwesenheit beider Spezies.
  • Entscheidend war, dass die WGS der linezolidhaltigen MGIT-Röhren (0,5 und 2,0 mg/L) nur M. sinense detektierte, jedoch kein Mycobacterium tuberculosis gefunden wurde.
  • Dies bestätigte, dass der M. tuberculosis-Stamm suszeptibel war (er wuchs in Gegenwart von Linezolid nicht), während der M. sinense-Stamm resistent war und wuchs, was dazu führte, dass das pDST das Mtb-Isolat fälschlicherweise als resistent deklarierte.
  • Das tNGS (Deeplex MycMTB) auf der drogenhaltigen Röhre detektierte M. kumamotonense, wobei das genomische Alignment nahelegte, dass der tatsächliche Kontaminant M. sinense war, was die Einschränkungen von Methoden zur Identifizierung einzelner Marker verdeutlicht.
• Klinischer Verlauf: Der Patient erhielt initial einen BPaL-L-Regime. Aufgrund der Unsicherheit der Linezolid-Suszeptibilität und der Positivität der Kultur im zweiten Monat wurde ein komplexes 9-Medikamenten-Regime empfohlen. Der Patient erreichte schließlich die Kulturkonversion. Die Isolate des zweiten Monats bestätigten die Mtb-Suszeptibilität gegenüber Linezolid, zeigten jedoch eine entstehende Resistenz gegen Bedaquilin und Clofazimin.

Bedeutung und Ansprüche
Das Paper behauptet, den ersten Fall einer Linezolid-pDST-gDST-Diskordanz zu berichten, bei dem die phänotypische Resistenz durch das Vorhandensein eines langsam wachsenden NTM (M. sinense) verursacht wurde und nicht durch ein falsch-negatives genotypisches Ergebnis oder ein technisches Versagen der WGS.

Die Autoren argumentieren, dass dieser Befund die vorherrschende Annahme infrage stellt, dass die Linezolid-Diskordanz primär auf die Unfähigkeit von NGS zurückzuführen ist, Resistenzmutationen zu detektieren. Stattdessen postulieren sie, dass das Vorhandensein von NTM in Kulturisolaten zu falsch-resistenten pDST-Ergebnissen führen kann. Die Studie kommt zu dem Schluss, dass bei vorliegenden Sequenzierungsergebnissen, die keine resistenzverursachende Mutation nachweisen, das Vorhandensein eines NTM mittels makroskopischer Untersuchung und Ziehl-Neelsen-Färbung untersucht werden sollte, bevor ein phänotypisches Ergebnis als Mtb-linezolid-resistent gemeldet wird. Die Autoren legen nahe, dass das Verständnis der Häufigkeit dieses Phänomens essenziell ist, um die wahre Sensitivität der NGS zur Detektion der Linezolid-Resistenz korrekt zu bewerten.