Linezolid phenotypic resistance in Mycobacterium tuberculosis due to presence of non-tuberculous mycobacteria:a case report

技術要約：非結核性抗酸菌による結核菌のリネゾリド表現型耐性

問題提起
表現型薬物感受性試験（pDST）と遺伝子型薬物感受性試験（gDT）の不一致は、リファンピシン耐性結核（RR-TB）における臨床的意思決定を困難にする。全ゲノム解析（WGS）を用いたgDSTは普及しつつあるが、未知の耐性メカニズムが存在する場合や、耐性サブ集団が検出限界を下回っている場合、偽陰性を生じる可能性がある。一方、pDSTは技術的な課題や混合感染により、偽陽性を生じる可能性がある。本症例報告では、pDSTで耐性が示されたものの、WGSではMycobacterium tuberculosis（Mtb）のrrlまたはrplc遺伝子に耐性決定変異が検出されなかった、リネゾリドの不一致に関する特定の事例を調査している。著者らは、リネゾリドがリボソームDNAを標的とする高度に保存されたメカニズムを持つことから、この不一致の原因は、汚染または非結核性抗酸菌（NTM）による混合感染であると仮定した。

方法論
本研究は、2025年に新たなエピソードと診断された、南アフリカの多剤耐性RR-TBの既往歴を持つ48歳の男性患者を中心としている。このpDST/gDSTの不一致を解決するために、多角的なアプローチを用いた：

• 初期検査： ベースライン分離株に対して、pDST（BACTEC MGIT960）およびIlluminaベースのWGSを実施した。また、ラインプローブアッセイも実施した。
• ディープシーケンシングおよびプロファイリング： 不一致を調査するため、著者らは以下を用いた：
  • NTM-Profiler (v0.8.2)： ベースラインのWGSデータに適用し、菌種および相対的な存在量を特定した。
  • ゲノムアライメント： Mtb（H37Rv参照配列）と特定されたNTM株（例：M. sinense JDM601）の間でrrlおよびrplc遺伝子をアライメントし、リネゾリド耐性に関連する部位の保存性を評価した。
  • 最小発育阻止濃度（MIC）測定： ベースライン分離株および特定の薬剤含有MGITチューブに対して実施した。
  • ターゲットNGS (tNGS)： リネゾリド含有pDSTチューブに対し、Deeplex MycMTBアッセイを適用した。
  • サブカルチャーWGS： ベースライン分離株および特定の増殖コントロール／薬剤含有チューブのサブカルチャーに対してWGSを行い、薬剤存在下での菌種組成を決定した。
• フォローアップ： 患者の2ヶ月目の培養分離株に対し、治療反応と新たな耐性の出現をモニタリングするため、Xpert MTB/XDR、WGS、および拡張pDSTを実施した。

主な結果

• 初期の不一致： ベースライン分離株はリネゾリドに対して表現型耐性（MIC ≥ 1 mg/L）を示したが、遺伝子型は感受性であった（rrlまたはrplcに変異なし）。
• 混合感染の特定：
  • ベースラインのWGSデータに対するNTM-Profiler分析により、混合感染（Mtb 34.6%、Mycobacterium sinense 65.4%）が明らかになった。
  • ゲノムアライメントにより、M. sinenseがリネゾリド耐性に関連する7つの部位においてMtbと高い同一性（rplcで84%、rrlで91%）を持つことが確認された。これが、NTMが表現型アッセイにおいて耐性と判定される理由である。
• 偽耐性のメカニズム：
  • 増殖コントロールチューブのWGSにより、両方の菌種が存在することが確認された。
  • 決定的なことに、リネゾリド含有MGITチューブ（0.5および2.0 mg/L）のWGSでは、M. sinenseのみが検出され、Mtbは検出されなかった。
  • これにより、Mtb株は感受性であり（リネゾリド存在下では増殖しなかった）、一方でM. sinense株が耐性を持ち増殖したことで、pDSTが誤ってMtb分離株を耐性と報告したことが確認された。
  • 薬剤チューブに対するtNGS（Deeplex MycMTB）ではM. kumamotonenseが検出されたが、ゲノムアライメントの結果、実際の汚染菌はM. sinenseであることが示唆され、単一マーカーによる同定法の限界が浮き彫りとなった。
• 臨床経過： 患者は当初、BPaL-L療法を受けた。リネゾリドの感受性の不確実性と2ヶ月目の培養陽性を考慮し、複雑な9剤併用療法が推奨された。患者は最終的に培養陰転化した。2ヶ月目の分離株は、Mtbのリネゾリド感受性を確認したが、ベダキリンおよびクロファジミンに対する耐性の出現を示した。

意義および主張
本論文は、表現型耐性がNGSによる耐性変異の検出失敗やWGSの技術的失敗ではなく、増殖の遅いNTM（M. sinense）の存在によって引き起こされた、リネゾリドのpDST-gDST不一致の最初の事例を報告したものであると主張している。

著者らは、リネゾリドの不一致は主にNGSが耐性変異を検出できないことに起因するという従来の仮説に疑問を投げかけている。代わりに、培養分離株におけるNTMの存在が、偽の耐性pDST結果を招く可能性があると提唱している。本研究は、WGSの結果が耐性決定変異を検出しない場合、表現型結果をMtbのリネゾリド耐性として報告する前に、顕微鏡検査およびチール・ネールゼン染色によるNTMの有無を調査すべきであると結論付けている。著者らは、リネゾリド耐性検出におけるNGSの真の感度を正確に評価するためには、この現象の頻度を理解することが不可欠であると示唆している。