Linezolid phenotypic resistance in Mycobacterium tuberculosis due to presence of non-tuberculous mycobacteria:a case report

Technische Samenvatting: Fenotypische resistentie tegen linezolid in Mycobacterium tuberculosis door niet-tuberculeuze mycobacteriën

Probleemstelling
Discordantie tussen fenotypische resistentiebepaling (pDST) en genotypische resistentiebepaling (gDST) compliceert de klinische besluitvorming bij rifampicine-resistente tuberculose (RR-TB). Hoewel gDST (via whole-genome sequencing, WGS) steeds vaker wordt gebruikt, kan dit vals-negatieve resultaten opleveren als resistentiemechanismen onbekend zijn of als resistente subpopulaties onder de detectiegrens liggen. Omgekeerd kan pDST vals-positieve resultaten opleveren door technische uitdagingen of de aanwezigheid van gemengde infecties. Dit casusverslag onderzoekt een specifiek geval van linezolid-discordantie waarbij pDST resistentie aangaf, maar WGS geen resistentieverhogende mutaties detecteerde in de rrl- of rplC-genen van Mycobacterium tuberculosis (Mtb). De auteurs hypothesiseerden dat deze discordantie werd veroorzaakt door contaminatie of een gemengde infectie met een niet-tuberculeuze mycobacterie (NTM), aangezien linezolid een ribosomaal DNA target heeft, een hoog geconserveerd mechanisme over verschillende bacteriesoorten heen.

Methodologie
De studie richt zich op een 4and 48-jarige mannelijke patiënt in Zuid-Afrika met een voorgeschiedenis van meerdere RR-TB episodes, bij wie in 2025 een nieuwe episode werd gediagnosticeerd. De investigatie maakte gebruik van een multimodale aanpak om de initiële pDST/gDST-discordantie op te lossen:

• Initiële testen: Baseline-isolaten ondergingen pDST (BACTEC MG1960) en Illumina-gebaseerde WGS. Een line probe assay werd eveneals uitgevoerd.
• Diepe sequencing en profilering: Om de discordantie te onderzoeken, gebruikten de auteurs:
  • NTM-Profiler (v0.8.2): Toegepast op baseline WGS-data om soorten en relatieve abundanties te identificeren.
  • Genomische alignment: Alignment van rrl- en rplC-genen tussen Mtb (H37Rv referentie) en geïdentificeerde NTM-stammen (bijv. M. sinense JDM601) om de conservering van resistentie-geassocieerde posities te beoordelen.
  • Minimum Inhibitory Concentration (MIC) assays: Uitgevoerd op het baseline-isolaat en specifieke medicijnbevattende MGIT-buizen.
  • Targeted NGS (tNGS): De Deeplex MycMTB assay werd toegepast op de linezolid-bevattende pDST-buis.
  • Subculture WGS: WGS werd uitgevoerd op subculturen van het baseline-isolaat en specifieke groeicontrole/medicijnbevattende buizen om de soortcompositie in aanwezigheid van het medicijn te bepalen.
• Follow-up: Het isolaat van de patiënt uit maand twee werd onderworpen aan Xpert MTB/XDR, WGS en uitgebreide pDST om de behandelingsrespons en opkomende resistentie te monitoren.

Belangrijkste resultaten

• Initiële discordantie: Het baseline-isolaat vertoonde fenotypische resistentie tegen linezolid (MIC ≥ 1 mg/L) maar genotypische gevoeligheid (geen varianten in rrl of rplC).
• Identificatie van gemengde infectie:
  • NTM-Profiler-analyse van de baseline WGS-data onthulde een gemengde infectie: 34,6% M. tuberculosis en 65,4% Mycobacterium sinense.
  • Genomische alignment bevestigde dat M. sinense een hoge identiteit bezit (84% voor rplC, 91% voor rrl) met Mtb op de zeven posities geassocieerd met linezolidresistentie, wat verklaart waarom de NTM als resistent zou verschijnen in een fenotypische assay.
• Mechanisme van valse resistentie:
  • WGS van de groeicontrolebuis bevestigde de aanwezigheid van beide soorten.
  • Cruciaal was dat WGS van de linezolid-bevattende MGIT-buizen (0,5 en 2,0 mg/L) alleen M. sinense detecteerde, zonder dat M. tuberculosis werd gedetecteerd.
  • Dit bevestigde dat de M. tuberculosis-stam gevoelig was (deze groeide niet in aanwezigheid van linezolid), terwijl de M. sinense-stam resistent was en groeide, waardoor de pDST ten onrechte rapporteerde dat het Mtb-isolaat resistent was.
  • De tNGS (Deeplex MycMTB) op de medicijnbuis detecteerde M. kumamotonense, maar genomische alignment suggereerde dat de werkelijke contaminant M. sinense was, wat de beperkingen van single-marker identificatiemethoden benadrukt.
• Klinisch verloop: De patiënt ontving aanvankelijk een BPaL-L regime. Vanwege de onzekerheid over de linezolidgevoeligheid en de cultuurpositiviteit in maand twee, werd een complex 9-drug regime aanbevolen. De patiënt bereikte uiteindelijk cultuurconversie. Isolaten van maand twee bevestigden de Mtb-gevoeligheid voor linezolid, maar onthulden opkomende resistentie tegen bedaquiline en clofazimine.

Betekenis en claims
Het artikel claimt het eerste geval te rapporteren van linezolid pDST-gDST discordantie waarbij de fenotypische resistentie werd veroorzaakt door de aanwezigheid van een traaggroeiende NTM (M. sinense) in plaats van een vals-negatief genotypisch resultaat of een technische fout van WGS.

De auteurs stellen dat deze bevinding de heersende aanname uitdaagt dat linezolid-discordantie primair wordt veroorzaakt door het onvermogen van NGS om resistentiemutaties te detecteren. In plaats daarvan postuleren zij dat de aanwezigheid van NTM in cultuurisolaten kan leiden tot vals-resistente pDST-resultaten. De studie concludeert dat wanneer sequencing-resultaten geen resistentie-verhogende mutatie detecteren, de aanwezigheid van een NTM onderzocht moet worden via macroscopische inspectie en Ziehl-Neelsen kleuring voordat een fenotypisch resultaat als Mtb linezolid-resistent wordt gerapporteerd. De auteurs suggereren dat het begrijpen van de frequentie van dit fenomeen essentieel is voor een nauwkeurige beoordeling van de werkelijke sensitiviteit van NGS voor de detectie van linezolidresistentie.