Water oxidation-driven histidine dioxidation enables probe-free proximity labeling

为了理解这项研究中科学家面临的挑战，人们必须首先了解他们是如何试图绘制活细胞内部那不可见的景观的。细胞并非空的液体袋，而是繁忙的城市，充满了像囊泡这样微小的、移动着的隔室，它们就像是运输蛋白质和物质的送货卡车。为了观察这些卡车内部是什么以及它们如何移动，研究人员使用了一种称为“邻近标记”（proximity labeling）的技术。想象一位摄影师试图在黑暗的房间里拍摄一个快速移动的物体。他们需要一个闪光灯来冻结动作，并有一种方法来标记物体，以便稍后能找到它。在生物学中，这种“闪光”是一种标记附近蛋白质的化学反应，而“标记”通常是由一个小分子探针添加的标签。然而，这种方法有一个盲点。如果探针因为细胞结构阻挡而无法物理接触到特定的隔室，那么该部分细胞将保持不可见。这对于内体（endosomes）和外泌体（exosomes）这类动态变化的结构尤其如此，因为化学工具的可及性是不均匀的，从而导致对细胞内部运作的描绘不完整且存在偏差。

由蔚山科学技术院的 Kwon Tae-Hyuk 领导的研究团队，以及来自首尔大学和布罗德研究所（Broad Institute）的同事们，开发了一种新的拍照方式，这种方式不再需要探针在初始“闪光”期间存在。他们创造了一种新的有机分子，将其命名为 IDM，作为一种光催化剂。当这种分子在活细胞内暴露于绿光下时，它会触发一种利用水和氧气的化学反应——这两种物质在细胞中无处不在——来产生高反应性的自由基。不同于以往依赖特定类型氧分子（即单线态氧）的方法（单线态氧会产生瞬间消失的不稳定中间体），IDM 会产生羟基自由基和超氧自由结合自由基。这些自由基协同作用，永久地改变一种被称为组氨酸（histidine）的特定氨基酸，这种氨基酸存在于许多蛋白质的表面。这种被称为“双氧化的过程”（dioxidation）的变化，将组氨酸转变为一种稳定的双内酰胺结构，这种结构可以长期存在而不发生分解。

这种方法的精妙之处在于时机。在传统方法中，化学探针必须在开启光照的准确时刻位于细胞内，以捕捉转瞬即逝的化学反应。如果探针无法进入特定的囊泡，其中的蛋白质就永远不会被标记。在使用新的 IDM 方法时，在细胞存活期间开启光照，IDM 分子氧化附近蛋白质上的组氨酸，将其锁定在这一稳定状态。随后细胞被破碎，只有在此之后才加入化学探针。由于组氨酸已被水基反应永久改变，探针可以在试管中轻松附着在其上，无论该探针此前是否能进入活细胞内的那个位置。这种被称为“无探针”（probe-free）的策略，作者称之为 PF-Map，使他们能够捕获更广泛、更准确的参与囊泡运输的蛋白质视图。

当研究人员应用这一新工具来研究细胞如何移动物质时，他们将这种无探针方法与传统的依赖探针的方法进行了对比。两种方法都成功识别了外泌体的已知标志物，外泌体是细胞用来相互沟通的小型囊泡。然而，无探针方法揭示了传统方法所遗漏的细胞活动隐藏层。它识别了 125 种额外的对囊泡运输至关重要的蛋白质，包括有助于管理这些细胞容器移动和出芽的特定蛋白质，如 Rab5、Rab11 和 SEC31A。这些蛋白质在传统方法中代表性不足，很可能是因为传统方法中使用的化学探针无法到达这些蛋白质所在的特定囊泡。通过将初始氧化步骤与活细胞内是否存在探针的需求解耦，研究人员得以绘制出一个更完整、偏差更小的细胞运输系统蛋白质组图谱。

该研究证实了这一新机制是通过特定的化学路径运作的。研究人员使用了包括质谱和电子顺磁共振在内的各种测试，以证明 IDM 是通过水产生羟基自由基，并通过氧气产生超氧自由基，而不是使用旧工具中的单线态氧。他们证明了这些自由基攻击组氨酸环，通过添加氧原子来创建一个不会恢复原状的稳定结构。这种稳定性是关键；它使得被标记的蛋白质能够在破碎细胞并进行分析的过程中得以存留。此外，团队展示了 IDM 分子本身对细胞是安全的，不会引起显著的损伤或细胞死亡，并且可以通过绿光激活，这种光照足够温和，不会对生物组织造成伤害。

最终，这项工作为观察细胞复杂的移动部件提供了一个新的视角。通过利用细胞自身的氧气和水在蛋白质上留下永久标记，并在稍后添加检测标签，科学家现在可以观察到那些此前被探针可及性障碍所遮蔽的蛋白质。研究人员发现，这种方法不仅证实了已知的生物学现象，还揭示了一个此前被低估的囊泡运输蛋白亚蛋白质组。这表明细胞的运输网络比之前认为的更加复杂和互联，例如 SEC31A 等蛋白质可能以此前难以检测的方式连接着不同的运输路径。这项研究建立了一种全新的、极小偏差的空间蛋白质组学策略，为以更高的清晰度和深度理解活体系统中动态生物过程的大门开启了新篇章。