Water oxidation-driven histidine dioxidation enables probe-free proximity labeling

Pour comprendre le défi auquel sont confrontés les scientifiques dans cette étude, il faut d'abord saisir comment ils tentent de cartographier le paysage invisible à l'intérieur d'une cellule vivante. Les cellules ne sont pas des sacs vides remplis de fluide ; ce sont des villes bouillonnantes remplies de petits compartiments mobiles comme des vésicules, qui agissent comme des camions de livraison transportant des protéines et du matériel. Pour voir ce qui se trouve à l'intérieur de ces camions et comment ils se déplacent, les chercheurs utilisent une technique appelée marquage par proximité. Imaginez un photographe essayant de prendre la photo d'un objet en mouvement rapide dans une pièce sombre. Il a besoin d'un flash pour figer le mouvement et d'un moyen de marquer l'objet pour qu'il puisse être retrouvé plus tard. En biologie, ce « flash » est une réaction chimique qui marque les protéines voisines, et la « marque » est généralement une étiquette ajoutée par une sonde moléculaire de petite taille. Cependant, cette méthode présente un angle mort. Si la sonde ne peut pas physiquement atteindre un compartiment spécifique parce que la structure de la cellule la bloque, cette partie de la cellule reste invisible. Cela est particulièrement vrai pour les structures dynamiques et changeantes comme les endosomes et les exosomes, où l'accessibilité des outils chimiques est inégale, conduisant à une image incomplète et biaisée du fonctionnement interne de la cellule.

Une équipe de chercheurs, dirigée par Tae-Hyuk Kwon de l'Institut national des sciences et technologies d'Ulsan et des collègues de l'Université nationale de Séoul et du Broad Institute, a développé une nouvelle façon de prendre cette photographie qui élimine la nécessité pour la sonde d'être présente lors du flash initial. Ils ont créé une nouvelle molécule organique, qu'ils ont nommée IDM, qui agit comme un photocatalyseur. Lorsque cette molécule est exposée à la lumière verte à l'intérieur d'une cellule vivante, elle déclenche une réaction chimique qui utilise l'eau et l'oxygène — deux substances présentes partout dans la cellule — pour créer des radicaux hautement réactifs. Contrairement aux méthodes précédentes qui reposent sur un type spécifique de molécule d'oxygène appelé oxygène singulet, qui crée des intermédiaires instables qui disparaissent instantanément, l'IDM génère des radicaux hydroxyle et superoxyde. Ces radicaux travaillent ensemble pour modifier de façon permanente un acide aminé spécifique appelé histidine, que l'on trouve à la surface de nombreuses protéines. Cette altération, connue sous le nom de dioxydation, transforme l'histidine en une structure de double-lactame stable qui peut persister pendant longtemps sans se désagréger.

La brillance de cette approche réside dans le timing. Dans les méthodes traditionnelles, la sonde chimique doit être à l'intérieur de la cellule au moment exact où la lumière est allumée pour capturer la réaction chimique éphémère. Si la sonde ne peut pas pénétrer dans une vésicule spécifique, les protéines à l'intérieur ne sont jamais marquées. Avec la nouvelle méthode IDM, la lumière est allumée alors que la cellule est vivante, et la molécule d'IDM oxyde les histidines des protéines voisines, les verrouillant dans cet état stable. La cellule est ensuite rompue, et ce n'est qu'après ce point que la sonde chimique est ajoutée. Parce que l'histidine a déjà été modifiée de façon permanente par la réaction à base d'eau, la sonde peut s'y attacher facilement dans le tube à essai, indépendamment du fait qu'elle aurait pu atteindre cet endroit à l'intérieur de la cellule vivante ou non. Cette stratégie « sans sonde », que les auteurs appellent PF-Map, leur permet de capturer une vue beaucoup plus large et plus précise des protéines impliquées dans le trafic vésiculaire.

Lorsque les chercheurs ont appliqué ce nouvel outil pour étudier comment les cellules déplacent le matériel, ils ont comparé leur méthode sans sonde à l'approche traditionnelle dépendante de la sonde. Les deux méthodes ont identifié avec succès des marqueurs bien connus pour les exosomes, qui sont de petites vésicules que les cellules libèrent pour communiquer entre elles. Cependant, la méthode sans sonde a révélé une couche cachée de l'activité cellulaire que la méthode traditionnelle avait manquée. Elle a identifié 125 protéines supplémentaires qui sont cruciales pour le trafic vésiculaire, incluant des protéines spécifiques comme Rab5, Rab11 et SEC31A, qui aident à gérer le mouvement et le bourgeonnement de ces conteneurs cellulaires. Ces protéines étaient sous-représentées dans la méthode traditionnelle, probablement parce que les sondes chimiques utilisées dans cette approche ne pouvaient pas atteindre les vésicules spécifiques où résident ces protéines. En découplant l'étape d'oxydation initiale du besoin de la présence d'une sonde dans la cellule vivante, les chercheurs ont pu cartographier un protéome plus complet et moins biaisé du système de transport de la cellule.

L'étude confirme que ce nouveau mécanisme fonctionne via une voie chimique spécifique. Les chercheurs ont utilisé divers tests, notamment la spectrométrie de masse et la résonance paramagnétique électronique, pour prouver que l'IDM génère des radicaux hydroxyle à partir de l'eau et des radicaux superoxyde à partir de l'oxygène, plutôt que l'oxygène singulet utilisé par les outils plus anciens. Ils ont démontré que ces radicaux attaquent l'anneau d'histidine, ajoutant des atomes d'oxygène pour créer une structure stable qui ne revient pas à sa forme originale. Cette stabilité est la clé ; elle permet aux protéines marquées de survivre au processus de rupture de la cellule et de préparation pour l'analyse. De plus, l'équipe a montré que la molécule d'IDM elle-même est sûre pour les cellules, ne causant aucun dommage ou décès significatif aux cellules sur lesquelles elle est utilisée, et qu'elle peut être activée par la lumière verte, qui est assez douce pour ne pas endommager les tissus biologiques.

En fin de compte, ce travail offre un nouveau regard pour observer les parties complexes et mobiles d'une cellule. En utilisant l'eau et l'oxygène de la cellule elle-même pour créer une marque permanente sur les protéines, puis en ajoutant l'étiquette de détection plus tard, les scientifiques peuvent désormais voir des protéines qui étaient auparavant cachées derrière des barrières d'accessibilité des sondes. Les chercheurs ont constaté que cette méthode non seulement confirme la biologie connue, mais révèle également un sous-protéome de protéines de trafic vésiculaire qui était auparavant sous-estimé. Cela suggère que le réseau de transport cellulaire est encore plus complexe et interconnecté que ce que l'on pensait auparavant, avec des protéines comme SEC31A reliant potentiellement différents voies de transport de manières qui étaient difficiles à détecter auparavant. L'étude établit une nouvelle stratégie, minimisant les biais pour la protéomique spatiale, ouvrant la porte à la compréhension des processus biologiques dynamiques dans les systèmes vivants avec plus de clarté et de profondeur.