Water oxidation-driven histidine dioxidation enables probe-free proximity labeling

この研究における科学者たちが直面している課題を理解するには、まず彼らがどのようにして生きている細胞内の目に見えない風景をマッピングしようとしているのかを把握する必要があります。細胞は単なる液体の入った空の袋ではありません。細胞は、タンパク質や物質を運搬するデリバリートラックの役割を果たす小胞のような、小さく動く区画で満たされた、活気ある都市なのです。これらのトラックの中に何が入っているのか、そしてそれらがどのように移動しているのかを見るために、研究者は「近接ラベル化（proximity labeling）」と呼ばれる技術を使用します。暗い部屋の中で素早く動く物体を撮影しようとしている写真家を想像してみてください。彼らは動きを止めるためのフラッシュと、後でその物体を見つけられるように目印をつける方法を必要としています。生物学において、この「フラッシュ」は近くのタンパク質に印をつける化学反応であり、「目印」は通常、小さな分子プローブによって追加されるタグです。しかし、この方法には盲点があります。もしプローブが細胞の構造によって物理的に特定の区画に到達できない場合、その部分の細胞は見えないままになってしまいます。これは、エンドソームやエクソソームのような動的で変化する構造において特に顕著であり、化学ツールのアクセシビリティ（到達しやすさ）が不均一であるため、細胞の内部機能の不完全で偏った描写につながります。

蔚山科学技術院のテ・ヒョク・クォン氏率いる研究チームと、ソウル大学およびブロード研究所の研究者たちは、最初の「フラッシュ」の間にプローブが存在する必要性を排除した、新しい写真の撮り方を開発しました。彼らは、光触媒として機能するIDMという新しい有機分子を創り出しました。この分子は、細胞内で緑色の光にさらされると、細胞内に至る所に存在する水と酸素を利用して、非常に反応性の高いラジカルを作り出す化学反応を引き起こします。従来の、一過性の中間体を作り出して瞬時に消えてしまう一重項酸素（シングレットオキジゲン）という特定の種類の酸素分子に依存する方法とは異なり、IDMはヒドロキシルラジカルとスーパーオキシドラジカルを生成します。これらのラジカルは協力して、多くのタンパク質の表面に存在するヒスチジンという特定のアミノ酸を永久に変質させます。ジオキシデーション（二酸化）として知られるこの変質は、ヒスチジンを、分解することなく長期間持続できる安定したダブルラクタム構造へと変化させます。

このアプローチの素晴らしさは、そのタイミングにあります。従来の方法では、化学プローブは、束の間の化学反応を捉えるために、光を点灯させる正確な瞬間に細胞内に存在していなければなりません。もしプローブが特定の小胞に入ることができなければ、その中のタンパク質は決してラベル付けされません。新しいIDM法では、細胞が生きている間に光を点灯させ、IDM分子が近くのタンパク質上のヒスチジンを酸化し、それらをこの安定した状態に固定します。その後、細胞を破砕し、その後に初めて化学プローブが添加されます。ヒスチジンはすでに水ベースの反応によって永久に変質しているため、たとえ細胞内でその場所に到達できなかったとしても、プローブは試験管内で容易に結合することができます。著者たちがPF-Mapと呼ぶこの「プローブフリー」戦略により、彼らは小胞輸送に関与するタンパク質のより広く正確なビューを捉えることができます。

研究者たちが細胞が物質を移動させる仕組みを研究するためにこの新しいツールを適用した際、彼らはプローブ依存型の従来の方法と、このプローブフリーの方法を比較しました。どちらの方法も、細胞が互いにコミュニケーションをとるために放出する小さな小胞であるエクソソームの既知のマーカーを特定することに成功しました。しかし、プローブフリー法は、従来のメソッドが見逃していた細胞活動の隠れた層を明らかにしました。それは、細胞の容器の移動や出芽を管理するのに役立つRab5、Rab11、SEC31Aといった特定のタンパク質を含む、小胞輸送に不可渉な125個の追加のタンパク質を特定しました。これらのタンパク質は、従来のメソッドでは過小評価されていました。これはおそらく、その手法で使用される化学プローブが、これらのタンパク質が存在する特定の小胞に到達できなかったためと考えられます。初期の酸化ステップを、細胞内にプローブが存在する必要性から切り離すことで、研究者たちは、細胞の輸送システムにおける、より完全で偏りの少ないプロテオームをマッピングすることができました。

この研究は、この新しいメカニズムが特定の化学経路を通じて機能することを裏付けています。研究者たちは、質量分析法や電子常磁性共鳴法を含む様々なテストを用いて、IDMが古いツールで使用される一重項酸素ではなく、水からのヒドロキシルラジカルと酸素からのスーパーオキシドラジカルを生成することを証明しました。彼らは、これらのラジカルがヒスチジン環を攻撃し、酸素原子を加えて元の形に戻ることのない安定した構造を作り出すことを実証しました。この安定性が鍵となります。これにより、ラベル付けされたタンパク質が、細胞を破砕し、分析の準備をするプロセスを生き延びることができるのです。さらに、チームはIDM分子自体が細胞に対して安全であり、使用される細胞に重大な損傷や死を与えないこと、そして生体組織を傷つけるのを避けるのに十分優しい緑色の光によって活性化できることを示しました。

結局のところ、この研究は、細胞の複雑に動くパーツを見るための新しいレンズを提供します。細胞自身の水と酸素を使用してタンパク質に永久的な印を付け、その後に検出タグを添加することで、科学者たちは以前はプローブのアクセシビリティという障壁の背後に隠されていたタンパク質を見ることができるようになりました。研究者たちは、この方法が既知の生物学を裏付けるだけでなく、以前は過小評価されていた小胞輸送タンパク質のサブプロテオームをも明らかにすることを発見しました。これは、細胞の輸送ネットワークが、以前考えられていたよりもさらに複雑で相互に関連しており、SEC31Aのようなタンパク質が、以前は検出が困難であった方法で異なる輸送経路を繋いでいる可能性を示唆しています。この研究は、空間プロテオミクスにおける、新しい、最小限のバイアスを持つ戦略を確立し、生きているシステムにおける動的な生物学的プロセスを、より高い明晰さと深さで理解するための扉を開きました。