Water oxidation-driven histidine dioxidation enables probe-free proximity labeling

Para comprender el desafío que enfrentan los científicos en este estudio, uno debe primero entender cómo intentan mapear el paisaje invisible dentro de una célula viva. Las células no son bolsas vacías de fluido; son ciudades bulliciosas llenas de compartimentos diminutos y móviles como las vesículas, que actan como camiones de reparto que transportan proteínas y materiales. Para ver qué hay dentro de estos camiones y cómo se mueven, los investigadores utilizan una técnica llamada etiquetado por proximidad. Imagine a un fotógrafo tratando de tomar una foto de un objeto que se mueve rápidamente en una habitación oscura. Necesitan un flash para congelar el movimiento y una forma de marcar el objeto para que pueda ser encontrado más tarde. En biología, este "flash" es una reacción química que marca las proteínas cercanas, y la "marca" es usualmente una etiqueta añadida por una pequeña sonda molecular. Sin embargo, este método tiene un punto ciego. Si la sonda no puede alcanzar físicamente un compartimento específico porque la estructura de la célula lo bloquea, esa parte de la célula permanece invisible. Esto es especialmente cierto para estructuras dinámicas y cambiantes como los endosomas y los exosomas, donde la accesibilidad de las herramientas químicas es desigual, lo que conduce a una imagen incompleta y sesgada del funcionamiento interno de la célula.

Un equipo de investigadores, liderado por Tae-Hyuk Kwon en el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología de Ulsan y colegas de la Universidad Nacional de Seúl y el Broad Institute, ha desarrollado una nueva forma de tomar esta fotografía que elimina la necesidad de que la sonda esté presente durante el flash inicial. Crearon una nueva molécula orgánica, a la que llamaron IDM, que actúa como un fotocatalizador. Cuando esta molécula se expone a la luz verde dentro de una célula viva, desencadena una reacción química que utiliza agua y oxígeno —dos sustancias que están en todas partes en la célula— para crear radicales altamente reactivos. A diferencia de los métodos anteriores que dependen de un tipo específico de molécula de oxígeno llamado oxígeno singlete, que crea intermediarios inestables que desaparecen instantáneamente, el IDM genera radicales hidroxilo y superóxido. Estos radicales trabajan juntos para alterar permanentemente un aminoácido específico llamado histidina, que se encuentra en la superficie de muchas proteínas. Esta alteración, conocida como dioxidación, cambia la histidina en una estructura de doble lactama estable que puede persistir durante mucho tiempo sin desarmarse.

La brillantez de este enfoque radica en el tiempo. En los métodos tradicionales, la sonda química debe estar dentro de la célula en el momento exacto en que se enciende la luz para capturar la fugaz reacción química. Si la sonda no puede entrar en una vesícula específica, las proteínas en su interior nunca son etiquetadas. Con el nuevo método IDM, la luz se enciende mientras la célula está viva, y la molécula de IDM oxida las histidinas en las proteínas cercanas, bloqueándolas en este estado estable. La célula se rompe entonces, y solo después de este punto se añade la sonda química. Debido a que la histidina ya ha sido permanentemente cambiada por la reacción basada en agua, la sonda puede unirse a ella fácilmente en el tubo de ensayo, independientemente de si podría haber alcanzado ese lugar dentro de la célula viva. Esta estrategia "libre de sonda", que los autores llaman PF-Map, les permite capturar una visión mucho más amplia y precisa de las proteínas involucradas en el tráfico de vesículas.

Cuando los investigadores aplicaron esta nueva herramienta para estudiar cómo las células mueven materiales, compararon su método libre de sonda contra el enfoque tradicional dependiente de sondas. Ambos métodos identificaron con éxito marcadores conocidos para los exosomas, que son pequeñas vesículas que las células liberan para comunicarse entre sí. Sin embargo, el método libre de sonda reveló una capa oculta de la actividad celular que el método tradicional pasó por alto. Identificó 125 proteínas adicionales que son cruciales para el tráfico de vesículas, incluyendo proteínas específicas como Rab5, Rab11 y SEC31A, que ayudan a gestionar el movimiento y la gemación de estos contenedores celulares. Estas proteínas estaban subrepresentadas en el método tradicional, probablemente debido a que las sondas químicas utilizadas en ese enfoque no podían alcanzar las vesículas específicas donde residen estas proteínas. Al desacoplar el paso de oxidación inicial de la necesidad de que una sonda esté presente en la célula viva, los investigadores pudieron mapear un proteoma más completo y menos sesgado del sistema de transporte celular.

El estudio confirma que este nuevo mecanismo funciona a través de una vía química específica. Los investigadores utilizaron diversas pruebas, incluyendo espectrometría de masas y resonancia paramagnética electrónica, para demostrar que el IDM genera radicales hidroxilo a partir del agua y radicales superóxido a partir del oxígeno, en lugar del oxígeno singlete utilizado por las herramientas más antiguas. Demostraron que estos radicales atacan el anillo de la histidina, añadiendo átomos de oxígeno para crear una estructura estable que no regresa a su forma original. Esta estabilidad es clave; permite que las proteínas etiquetadas sobrevivan al proceso de romper la célula y prepararlas para el análisis. Además, el equipo demostró que la molécula de IDM es segura para las células, no causa daños significativos ni la muerte de las células sobre las que se utiliza, y puede ser activada por luz verde, la cual es lo suficientemente suave como para evitar dañar el tejido biológico.

Al final, este trabajo ofrece un nuevo lente para mirar las partes complejas y móviles de una célula. Al usar el propio agua y oxígeno de la célula para crear una marca permanente en las proteínas, y luego añadir la etiqueta de detección más tarde, los científicos pueden ahora ver proteínas que antes estaban ocultas tras barreras de accesibilidad de las sondas. Los investigadores encontraron que este método no solo confirma la biología conocida, sino que también descubre un sub-proteoma de proteínas de tráfico de vesículas que anteriormente se había subestimado. Esto sugiere que la red de transporte celular es aún más intrincada e interconectada de lo que se pensaba anteriormente, con proteínas como SEC31A potencialmente vinculando diferentes vías de transporte de formas que eran difíciles de detectar antes. El estudio establece una nueva estrategia mínimamente sesgada para la proteómica espacial, abriendo la puerta a la comprensión de los procesos biológicos dinámicos en sistemas vivos con mayor claridad y profundidad.