Water oxidation-driven histidine dioxidation enables probe-free proximity labeling

Om de uitdaging te begrijpen waarmee wetenschappers in dit onderzoek worden geconfronteerd, moet men eerst begrijpen hoe zij proberen het onzichtbare landschap binnen een levende cel in kaart te brengen. Cellen zijn geen lege zakken met vloeistof; het zijn bruisende steden vol kleine, bewegende compartimenten zoals vesikels, die fungeren als bezorgwagens die eiwitten en materialen transporteren. Om te zien wat er in deze wagens zit en hoe ze bewegen, gebruiken onderzoekers een techniek genaamd proximity labeling (nabijheidslabeling). Stel je een fotograaf voor die probeert een foto te maken van een snel bewegend object in een donkere kamer. Hij heeft een flits nodig om de beweging te bevriezen en een manier om het object te markeren zodat het later gevonden kan worden. In de biologie is deze "flits" een chemische reactie die nabijgelegen eiwitten markeert, en de "markering" is meestal een tag die wordt toegevoegd door een klein moleculaire sonde. Deze methode heeft echter een blinde vlek. Als de sonde een specifiek compartiment fysiek niet kan bereiken omdat de structuur van de cel dit blokkeert, blijft dat deel van de cel onzichtbaar. Dit geldt vooral voor dynamische, verschuivende structuren zoals endosomen en exosomen, waarbij de toegankelijkheid van chemische hulpmiddelen ongelijkmatig is, wat leidt tot een onvolledig en bevooroordeeld beeld van de interne werking van de cel.

Een team van onderzoekers, onder leiding van Tae-Hyuk Kwon van het Ulsan National Institute of Science and Technology en collega's van de Seoul National University en het Broad Institute, heeft een nieuwe manier ontwikkeld om deze foto te maken die de noodzaak wegneemt dat de sonde aanwezig moet zijn tijdens de initiële flits. Ze creëerden een nieuw organisch molecuul, dat ze IDM noemden, dat fungeert als een fotokatalysator. Wanneer dit molecuul wordt blootgesteld aan groen licht binnen een levende cel, triggert het een chemische reactie die water en zuurstof gebruikt—twee stoffen die overal in de cel aanwezig zijn—om zeer reactieve radicalen te creëren. In tegen tegenstelling tot eerdere methoden die vertrouwen op een specifiek type zuurstofmolecuul genaamd singletzuurstof, dat instabiele tussenproducten creëert die onmiddellijk verdwijnen, genereert IDM hydroxyl- en superoxideradicalen. Deze radicalen werken samen om een specifiek aminozuur genaamd histidine permanent te veranderen, dat wordt gevonden op het oppervlak van veel eiwitten. Deze verandering, bekend als dioxidatie, verandert het histidine in een stabiele, dubbele lactamstructuur die langdurig kan blijven bestaan zonder uit elkaar te vallen.

De genialiteit van deze aanpak ligt in de timing. Bij traditionele methoden moet de chemische sonde in de cel aanwezig zijn op het exacte moment dat het licht wordt aangezet om de vluchtige chemische reactie te vangen. Als de sonde een specifiek vesikel niet in kan komen, worden de eiwitten daarin nooit gelabeld. Met de nieuwe IDM-methode wordt het licht aangezet terwijl de cel leeft, en oxideert het IDM-molecuul de histidines op nabijgelegen eiwitten, waardoor ze in deze stabiele staat worden vergrendeld. De cel wordt vervolgens opengebroken, en pas na dat punt wordt de chemische sonde toegevoegd. Omdat het histidine al permanent is veranderd door de watergebaseerde reactie, kan de sonde zich er in het reageerbuisje gemakkelijk aan hechten, ongeacht of het die plek in de levende cel had kunnen bereiken. Deze "probe-vrije" strategie, die de auteurs PF-Map noemen, stelt hen in staat om een veel breder en nauwkeuriger beeld te krijgen van de eiwitten die betrokken zijn bij het vesikeltransport.

Toen de onderzoekers dit nieuwe instrument toepasten om te bestuderen hoe cellen materialen verplaatsen, vergeleken ze hun probe-vrije methode met de traditionele probe-afhankelijke aanpak. Beide methoden identificeerden succesvol bekende markers voor exosomen, wat kleine vesikels zijn die cellen vrijgeven om met elkaar te communiceren. De probe-vrije methode onthulde echter een verborgen laag van de cellulaire activiteit die de traditionele methode miste. Het identificeerde 125 extra eiwitten die cruciaal zijn voor het vesikeltransport, inclusief specifieke eiwitten zoals Rab5, Rab11 en SEC31A, die helpen bij het beheren van de beweging en het uitstulpen van deze cellulaire containers. Deze eiwitten waren ondervertegenwoordigd in de traditionele methode, waarschijnlijk omdat de chemische sondes die in die aanpak werden gebruikt, de specifieke vesikels waar deze eiwitten zich bevinden, niet konden bereiken. Door de initiële oxidatiestap te ontkoppelen van de noodzaak voor de aanwezigheid van een sonde in de levende cel, waren de onderzoekers in staat om een completer en minder bevooroordeeld proteoom van het transportsysteem van de cel in kaart te brengen.

De studie bevestigt dat dit nieuwe mechanisme werkt via een specifie een specifiek chemisch pad. De onderzoekers gebruikten diverse tests, waaronder massaspectrometrie en elektron spinsresonantie, om te bewijzen dat IDM hydroxylradicalen genereert uit water en superoxideradicalen uit zuurstof, in plaats van de singletzuurstof die door oudere instrumenten wordt gebruikt. Ze toonden aan dat deze radicalen het histidine-ring aanvallen, zuurstofatomen toevoegen om een stabiele structuur te creëren die niet terugkeert naar de oorspronkelijke vorm. Deze stabiliteit is essentieel; het stelt de gelabelde eiwitten in staat om het proces van het openbreken van de cel en het voorbereiden van deze voor analyse te overleven. Bovendien toonde het team aan dat het IDM-molecuul zelf veilig is voor cellen, geen significante schade of dood aan de cellen veroorzaakt waarop het wordt gebruikt, en dat het geactiveerd kan worden door groen licht, wat zacht genoeg is om biologisch weefsel te vermijden.

Uiteindelijk biedt dit werk een nieuwe lens om naar de complexe, bewegende onderdelen van een cel te kijken. Door het water en de zuurstof van de cel zelf te gebruiken om een permanente markering op eiwitten aan te brengen, en vervolgens de detectietag later toe te voegen, kunnen wetenschappers nu eiwitten zien die voorheen verborgen waren achter barrières van probe-toegankelijkheid. De onderzoekers ontdekten dat deze methode niet alleen de bekende biologie bevestigt, maar ook een sub-proteoom van vesikeltransport-eiwitten onthult die voorheen onderschat werd. Dit suggereert dat het transportnetwerk van de cel nog complexer en meer onderling verbonden is dan voorheen gedacht, met eiwitten zoals SEC31A die potentieel verschillende transportpaden koppelen op manieren die voorheen moeilijk te detecteren waren. De studie vestigt een nieuwe, minimaal bevooroordeelde strategie voor ruimtelijke proteomics, wat de deur opent naar een begrip van dynamische biologische processen in levende systemen met grotere helderheid en diepgang.