Water oxidation-driven histidine dioxidation enables probe-free proximity labeling

Per comprendere la sfida affrontata dagli scienziati in questo studio, è necessario innanzitutto comprendere come essi tentino di mappare il paesaggio invisibile all'interno di una cellula vivente. Le cellule non sono sacchetti vuoti di fluido; sono città frenetiche piene di piccoli compartimenti in movimento come le vescicole, che agiscono come camioncini per consegne trasportando proteine e materiali. Per vedere cosa c'è dentro questi camioncini e come si muovono, i ricercatori utilizzano una tecnica chiamata marcatura per prossimità. Immaginate un fotografo che cerca di scattare una foto a un oggetto in rapido movimento in una stanza buia. Ha bisogno di un flash per congelare il movimento e di un modo per marcare l'oggetto in modo che possa essere trovato in seguito. In biologia, questo "flash" è una reazione chimica che marca le proteine vicine, e il "marchio" è solitamente un tag aggiunto da una sonda a base di una piccola molecola. Tuttavia, questo metodo ha un punto cieco. Se la sonda non può fisicamente raggiungere un compartimento specifico perché la struttura della cellula lo blocca, quella parte della cellula rimane invisibile. Questo è particolarmente vero per strutture dinamiche e mutevoli come gli endosomi e gli esosomi, dove l'accessibilità degli strumenti chimici è disomogenea, portando a un quadro incompleto e distorto del funzionamento interno della cellula.

Un team di ricercatori, guidato da Tae-Hyuk Kwon presso l'Istituto Nazionale di Scienza e Tecnologia di Ulsan e colleghi della Seoul National University e del Broad Institute, ha sviluppato un nuovo modo per scattare questa fotografia che elimina la necessità che la sonda sia presente durante il flash iniziale. Hanno creato una nuova molecola organica, che hanno chiamato IDM, che agisce come un fotocatalizzatore. Quando questa molecola viene esposta alla luce verde all'interno di una cellula vivente, innesca una reazione chimica che utilizza acqua e ossigeno — due sostanze che sono ovunque nella cellula — per creare radicali altamente reattivi. A differenza dei metodi precedenti che si affidano a un tipo specifico di molecola di ossigeno chiamato ossigeno singoletto, che crea intermedi instabili che scompaiono istantaneamente, l'IDM genera radicali ossidrilici e superossido. Questi radicali lavorano insieme per alterare permanentemente un amminoacido specifico chiamato istidina, che si trova sulla superficie di molte proteine. Questa alterazione, nota come diossidazione, trasforma l'istidina in una struttura a doppia lattame stabile che può persistere per molto tempo senza decomporsi.

La genialità di questo approccio risiede nella tempistica. Nei metodi tradizionali, la sonda chimica deve trovarsi all'interno della cella nel momento esatto in cui la luce viene accesa per catturare la fugace reazione chimica. Se la sonda non può entrare in una specifica vescicola, le proteine al suo interno non vengono mai marcate. Con il nuovo metodo IDM, la luce viene accesa mentre la cellula è viva, e la molecola IDM ossida le istidine sulle proteine vicine, bloccandole in questo stato stabile. La cellula viene poi rotta, e solo dopo questo punto viene aggiunta la sonda chimica. Poiché l'istidina è già stata permanentemente modificata dalla reazione basata sull'acqua, la sonda può attaccarsi ad essa facilmente nella provetta, indipendentemente dal fatto che avrebbe potuto raggiungere quel punto all'interno della cella vivente. Questa strategia "senza sonda", che gli autori chiamano PF-Map, permette loro di catturare una visione molto più ampia e accurata delle proteine coinvolte nel traffico vescicolare.

Quando i ricercatori hanno applicato questo nuovo strumento per studiare come le cellule muovono i materiali, hanno confrontato il loro metodo privo di sonda con l'approccio tradizionale dipendente dalla sonda. Entrambi i metodi hanno identificato con successo noti marcatori per gli esosomi, che sono piccole vescicole che le cellule rilasciano per comunicare tra loro. Tuttavia, il metodo privo di sonda ha rivelato uno strato nascosto dell'attività cellulare che il metodo tradizionale ha mancato. Ha identificato 125 proteine aggiuntive che sono cruciali per il traffico vescicolare, incluse proteine specifiche come Rab5, Rab11 e SEC31A, che aiutano a gestire il movimento e il gemimento di questi contenitori cellulari. Queste proteine erano sottorappresentate nel metodo tradizionale, probabilmente perché le sonde chimiche utilizzate in quell'approccio non potevano raggiungere le vescicole specifiche in cui risiedono queste proteine. Decoppiando la fase iniziale di ossidazione dalla necessità che una sonda sia presente nella cella vivente, i ricercatori sono stati in grado di mappare un proteoma più completo e meno distorto del sistema di trasporto cellulare.

Lo studio conferma che questo nuovo meccanismo funziona attraverso un percorso chimico specifico. I ricercatori hanno utilizzato vari test, inclusi la spettrometria di massa e la risonanza paramagnetica elettronica, per dimostrare che l'IDM genera radicali ossidrilici dall'acqua e radicali superossido dall'ossigeno, piuttosto che l'ossigeno singoletto usato dagli strumenti più vecchi. Hanno dimostrato che questi radicali attaccano l'anello dell'istidina, aggiungendo atomi di ossigeno per creare una struttura stabile che non ritorna alla sua forma originale. Questa stabilità è fondamentale; permette alle proteine marcate di sopravvivere al processo di rottura della cellula e di preparazione per l'analisi. Inoltre, il team ha dimostrato che la molecola IDM stessa è sicura per le cellule, non causando danni o morte significativi alle cellule su cui viene utilizzata, e può essere attivata dalla luce verde, che è abbastanza delicata da evitare di danneggiare il tessuto biologico.

In definitiva, questo lavoro offre una nuova lente per osservare le parti complesse e in movimento di una cellula. Utilizzando l'acqua e l'ossigeno della cellula stessa per creare un marchio permanente sulle proteine, e aggiungendo successivamente il tag di rilevamento, gli scienziati possono ora vedere proteine che erano precedentemente nascoste dietro barriere di accessibilità delle sonde. I ricercatori hanno scoperto che questo metodo non solo conferma la biologia nota, ma scopre anche un sub-proteoma di proteine del traffico vescicolare che era precedentemente sottostimato. Ciò suggerisce che la rete di trasporto cellulare è ancora più intricata e interconnessa di quanto precedentemente pensato, con proteine come SEC31A che potenzialmente collegano diversi percorsi di trasporto in modi che erano difficili da rilevare in precedenza. Lo studio stabilisce una nuova strategia, minimamente distorta, per la proteomica spaziale, aprendo la porta alla comprensione dei processi biologici dinamici nei sistemi viventi con maggiore chiarezza e profondità.