Water oxidation-driven histidine dioxidation enables probe-free proximity labeling

이 연구에서 과학자들이 직면한 과제를 이해하려면, 먼저 그들이 살아있는 세포 내부의 보이지 않는 풍경을 어떻게 지도화하려고 시도하는지 파악해야 합니다. 세포는 단순히 액체가 담긴 빈 가방이 아닙니다. 세포는 단백질과 물질을 운반하는 배달 트럭 역할을 하는 소포체(vesicles)와 같은 작고 움직이는 구획들로 가득 찬 북적이는 도시와 같습니다. 이 트럭 안에 무엇이 들어 있고 그것들이 어떻게 움직이는지 보기 위해, 연구자들은 근접 표지법(proximity labeling)이라는 기술을 사용합니다. 마치 어두운 방 안에서 빠르게 움직이는 물체의 사진을 찍으려는 사진가라고 상상해 보십시오. 그들은 움직임을 멈추게 할 플래시와, 나중에 물체를 찾을 수 있도록 물체를 표시할 방법이 필요합니다. 생물학에서 이 "플래시"는 주변 단백질을 표시하는 화학 반응이며, "표시"는 대개 작은 분자 프로브(probe)에 의해 추가되는 태그입니다. 그러나 이 방법에는 사각지대가 있습니다. 만약 프로브가 세포의 구조에 의해 차단되어 특정 구획에 물리적으로 도달할 수 없다면, 그 부분의 세포는 보이지 않는 상태로 남게 됩니다. 이는 엔도솜(endosomes)이나 엑소좀(exosomes)처럼 역동적이고 변화하는 구조에서 특히 두드러지는데, 화학적 도구의 접근성이 불균일하여 세포 내부 작동 방식에 대해 불완전하고 편향된 그림을 제공하기 때문입니다.

Tae-Hyuk Kwon이 이끄는 울산과학기술원(UNIST)의 연구팀과 서울대학교 및 브로드 연구소(Broad Institute)의 동료들은 초기 플래시가 일어나는 동안 프로브가 존재할 필요가 없는, 이 사진을 찍는 새로운 방법을 개발했습니다. 그들은 광촉매 역할을 하는 IDM이라는 새로운 유기 분자를 만들었습니다. 이 분자가 살아있는 세포 내부에서 녹색 빛에 노출되면, 세포 어디에나 존재하는 두 물질인 물과 산소를 사용하여 매우 반응성이 높은 라디칼(radicals)을 생성하는 화학 반응을 유발합니다. 불안정한 중간체를 생성하여 즉시 사라지는 특정 유형의 싱글렛 산소(singlet oxygen)에 의존하는 기존 방식과 달리, IDM은 하이드록실(hydroxyl) 및 슈퍼옥사이드(superoxide) 라디칼을 생성합니다. 이 라디칼들은 함께 작용하여 많은 단백질 표면에 존재하는 히스티딘(histidine)이라는 특정 아미노산을 영구적으로 변형시킵니다. 디옥시데이션(dioxidation)이라고 알려진 이 변형은 히스티딘을 분해되지 않고 오랫동안 지속될 수 있는 안정적인 이중 락탐(double-lactam) 구조로 변화시킵니다.

이 접근 방식의 탁월함은 타이밍에 있습니다. 전통적인 방식에서는 빛을 켜는 바로 그 순간에 화학 프로브가 세포 안에 있어야만 찰나의 화학 반응을 포착할 수 있습니다. 만약 프로브가 특정 소포 내부로 들어갈 수 없다면, 그 안의 단백질들은 결코 표지되지 않습니다. 새로운 IDM 방식에서는 세포가 살아있는 동안 빛을 켜고, IDM 분자가 주변 단백질의 히스티딘을 산화시켜 이를 안정적인 상태로 고정합니다. 그 후 세포를 파쇄하며, 이 시점이 지나서야 화학 프로브를 추가합니다. 히스티딘이 물 기반 반응에 의해 이미 영구적으로 변형되었기 때문에, 프로브는 시험관 내에서 쉽게 히스티딘에 결합할 수 있으며, 이는 세포 내부의 해당 지점에 도달할 수 있었는지 여부와 상관없이 가능합니다. 저자들이 PF-Map라고 부르는 이 "프로브 프리(probe-free)" 전략을 통해, 연구진은 소포 수송에 관여하는 단백질들에 대해 훨씬 더 넓고 정확한 시야를 확보할 수 있었습니다.

연구진이 세포의 물질 이동을 연구하기 위해 이 새로운 도구를 적용했을 때, 그들은 프로브 의존적 방식과 프로브 프리 방식을 비교했습니다. 두 방법 모두 세포가 서로 소통하기 위해 방출하는 작은 소포인 엑소좀의 잘 알려진 마커들을 성공적으로 식별했습니다. 그러나 프로브 프리 방식은 전통적인 방식이 놓쳤던 세포 활동의 숨겨진 층을 드러냈습니다. 이 방식은 Rab5, Rab11, SEC31A와 같이 세포 용기의 이동과 출아(budding)를 돕는 특정 단백질들을 포함하여, 소포 수송에 중요한 125개의 추가 단백질을 식별해 냈습니다. 이러한 단백질들은 전통적인 방식에서 과소 대표되었는데, 이는 아마도 그 방식에 사용된 화학 프로브가 이 단백질들이 존재하는 특정 소포에 도달할 수 없었기 때문일 것입니다. 초기 산화 단계를 살아있는 세포 내 프로브의 존재와 분리함으로써, 연구진은 세포의 수송 시스템에 대한 더 완전하고 편향되지 않은 프로테옴(proteome)을 지도화할 수 있었습니다.

이 연구는 새로운 메커니즘이 특정 화학적 경로를 통해 작동함을 확인해 줍니다. 연구진은 질량 분석법(mass spectrometry)과 전자 상자성 공명(electron paramagnetic resonance)을 포함한 다양한 테스트를 사용하여, IDM이 기존 도구들이 사용하는 싱글렛 산소가 아니라 물로부터 하이드록실 라디칼을, 산소로부터 슈퍼옥사이드 라디칼을 생성한다는 것을 입증했습니다. 그들은 이 라디칼들이 히스티딘 고리를 공격하여 산소 원자를 추가함으로써 원래의 형태로 되돌아가지 않는 안정적인 구조를 만든다는 것을 보여주었습니다. 이 안정성이 핵심입니다. 이는 표지된 단백질들이 세포를 파쇄하고 분석을 준비하는 과정에서도 살아남을 수 있게 해줍니다. 또한, 연구팀은 IDM 분자 자체가 세포에 안전하며, 사용되는 세포에 유의미한 손상이나 죽음을 일으키지 않고, 생물학적 조직에 해를 끼치지 않을 만큼 부드러운 녹색 빛에 의해 활성화될 수 있음을 보여주었습니다.

결국, 이 연구는 세포의 복잡하고 움직이는 부품들을 바라보는 새로운 렌즈를 제공합니다. 세포 자체의 물과 산소를 사용하여 단백질에 영구적인 표식을 남기고, 그 후에 탐지 태그를 추가함으로써, 과학자들은 이제 프로브 접근성의 장벽 뒤에 숨겨져 있던 단백질들을 볼 수 있게 되었습니다. 연구진은 이 방법이 알려진 생물학적 사실을 확인할 뿐만 아니라, 이전에 과소평가되었던 소포 수송 단백질의 하위 프로테옴을 밝혀낸다는 것을 발견했습니다. 이는 세포의 수송 네트워크가 이전에 생각했던 것보다 훨씬 더 복잡하고 상호 연결되어 있음을 시사하며, 예를 들어 SEC31A와 같은 단백질이 이전에는 탐지하기 어려웠던 방식으로 서로 다른 수송 경로를 연결하고 있을 가능성을 보여줍니다. 이 연구는 공간 단백질체학(spatial proteomics)을 위한 새롭고 편향을 최소화한 전략을 확립하며, 살아있는 시스템의 역동적인 생물학적 과정을 더 명확하고 깊이 있게 이해할 수 있는 문을 열어주었습니다.