Water oxidation-driven histidine dioxidation enables probe-free proximity labeling

Um die Herausforderung zu verstehen, vor der Wissenschaftler in dieser Studie stehen, muss man zunächst begreifen, wie sie versuchen, die unsichtbare Landschaft im Inneren einer lebenden Zelle abzubilden. Zellen sind keine leeren Beutel voller Flüssigkeit; sie sind geschäftige Städte, gefüllt mit winzigen, beweglichen Kompartimenten wie Vesikeln, die als Lieferwagen fungieren und Proteine sowie Materialien transportieren. Um zu sehen, was sich in diesen Lastwagen befindet und wie sie sich bewegen, nutzen Forscher eine Technik namens Proximity Labeling (Näherungsmarkierung). Stellen Sie sich einen Fotografen vor, der versucht, ein Foto von einem sich schnell bewegenden Objekt in einem dunklen Raum zu machen. Er benötigt einen Blitz, um die Bewegung einzufrieren, und eine Möglichkeit, das Objekt zu markieren, damit es später gefunden werden kann. In der Biologie ist dieser „Blitz“ eine chemische Reaktion, die nahegelegene Proteine markiert, und das „Merkmal“ ist meist ein Tag, der durch eine kleine Molekülsonde hinzugefügt wird. Diese Methode hat jedoch einen blinden Fleck. Wenn die Sonde ein bestimmtes Kompartiment aufgrund der Zellstruktur physisch nicht erreichen kann, bleibt dieser Teil der Zelle unsichtbar. Dies gilt insbesondere für dynamische, sich verändernde Strukturen wie Endosomen und Exosomen, bei denen die Zugänglichkeit chemischer Werkzeuge ungleichmäßig ist, was zu einem unvollständigen und verzerrten Bild der inneren Abläufe der Zelle führt.

Ein Team von Forschern unter der Leitung von Tae-Hyuk Kwon vom Ulsan National Institute of Science and Technology und Kollegen der Seoul National University und des Broad Institute hat eine neue Art entwickelt, dieses Foto zu machen, die die Notwendigkeit der Anwesenheit der Sonde während des anfänglichen Blitzes aufhebt. Sie entwickelten ein neues organisches Molekül, das sie IDM nannten und das als Photokatalysator fungiert. Wenn dieses Molekül in einer lebenden Zelle grünem Licht ausgesetzt wird, löst es eine chemische Reaktion aus, die Wasser und Sauerstoff verwendet – zwei Substanzen, die überall in der Zelle vorhanden sind –, um hochreaktive Radikale zu erzeugen. Im Gegensatz zu bisherigen Methoden, die auf eine bestimmte Art von Sauerstoffmolekül, dem sogenannten Singulett-Sauerstoff, angewiesen sind, der instabile Zwischenprodukte erzeugt, die sofort wieder verschwinden, erzeugt IDM Hydroxyl- und Superoxid-Radikale. Diese Radikale arbeiten zusammen, um eine spezifische Aminosäure namens Histidin dauerhaft zu verändern, die auf der Oberfläche vieler Proteine zu finden ist. Diese Veränderung, bekannt als Dioxidation, wandelt das Histidin in eine stabile Doppel-Lactam-Struktur um, die über lange Zeit bestehen bleiben kann, ohne zerfallen.

Die Brillanz dieses Ansatzes liegt im Timing. Bei herkömmlichen Methoden muss die chemische Sonde zum exakten Zeitpunkt, an dem das Licht eingeschaltet wird, innerhalb der Zelle vorhanden sein, um die flüchtige chemische Reaktion einzufangen. Wenn die Sonde ein bestimmtes Vesikel nicht betreten kann, werden die darin befindlichen Proteine nie markiert. Mit der neuen IDM-Methode wird das Licht eingeschaltet, während die Zelle lebt, und das IDM-Molekül oxidiert die Histidine auf nahegelegenen Proteinen, wodurch diese in diesen stabilen Zustand fixiert werden. Die Zelle wird dann aufgebrochen, und erst nach diesem Punkt wird die chemische Sonde hinzugefügt. Da das Histidin durch die wasserbasierte Reaktion bereits dauerhaft verändert wurde, kann sich die Sonde im Reagenzglas leicht an dieses binden, unabhängig davon, ob sie diesen Ort innerhalb der lebenden Zelle hätte erreichen können. Diese „sondenfreie“ Strategie, die die Autoren als PF-Map bezeichnen, ermöglicht es ihnen, eine viel breitere und genauere Sicht auf die an der Vesikel-Translokation beteiligten Proteine zu gewinnen.

Als die Forscher dieses neue Werkzeug anwandten, um zu untersuchen, wie Zellen Materialien bewegen, verglichen sie ihre sondenfreie Methode mit dem traditionellen, sondenabhängigen Ansatz. Beide Methoden identifizierten erfolgreich bekannte Marker für Exosomen, also kleine Vesikel, die Zellen zur Kommunikation miteinander freisetzen. Die sondenfreie Methode enthüllte jedoch eine verborgene Ebene der zellulären Aktivität, die die traditionelle Methode übersah. Sie identifizierte 125 zusätzliche Proteine, die entscheidend für den Vesikeltransport sind, einschließlich spezifischer Proteine wie Rab5, Rab11 und SEC31A, die beim Management der Bewegung und Knospung dieser zellulären Behälter helfen. Diese Proteine waren in der traditionellen Methode unterrepräsentiert, wahrscheinlich weil die in jenem Ansatz verwendeten chemischen Sonden nicht die spezifischen Vesikel erreichen konnten, in denen diese Proteine residieren. Durch die Entkopplung des anfänglichen Oxidationsschritts von der Notwendigkeit, dass eine Sonde in der lebenden Zelle vorhanden sein muss, konnten die Forscher ein vollständigeres und weniger verzerrtes Proteom des Transportsystems der Zelle kartieren.

Die Studie bestätigt, dass dieser neue Mechanismus über einen spezifischen chemischen Pfad funktioniert. Die Forscher nutzten verschiedene Tests, einschließlich Massenspektrometrie und Elektronenspinresonanz, um zu beweisen, dass IDM Hydroxyl-Radikale aus Wasser und Superoxid-Radikale aus Sauerstoff erzeugt, anstatt des Singulett-Sauerstoffs, der bei älteren Werkzeugen verwendet wird. Sie zeigten, dass diese Radikale den Histidinring angreifen und Sauerstoffatome hinzufügen, um eine stabile Struktur zu schaffen, die nicht in ihre ursprüngliche Form zurückkehrt. Diese Stabilität ist entscheidend; sie ermöglicht es den markierten Proteinen, den Prozess des Aufbrechens der Zelle und der Vorbereitung auf die Analyse zu überstehen. Darüber hinaus zeigten die Teammitglieder, dass das IDM-Molekül selbst sicher für Zellen ist, keine signifikanten Schäden oder Todesfälle in den verwendeten Zellen verursacht und durch grünes Licht aktiviert werden kann, was schonend genug ist, um biologisches Gewebe nicht zu schädigen.

Letztendlich bietet diese Arbeit eine neue Linse, um die komplexen, beweglichen Teile einer Zelle zu betrachten. Indem sie das eigene Wasser und den Sauerstoff der Zelle nutzen, um eine dauerhafte Markierung an Proteinen zu erzeugen, und dann den Detektions-Tag später hinzufügen, können Wissenschaftler nun Proteine sehen, die zuvor hinter Barrieren der Sonden-Zugänglichkeit verborgen waren. Die Forscher fanden heraus, dass diese Methode nicht nur die bekannte Biologie bestätigt, sondern auch ein Sub-Proteom von Vesikel-Transportproteinen aufdeckt, das zuvor unterschätzt wurde. Dies deutet darauf an, dass das Transportnetzwerk der Zelle noch komplizierter und vernetzter ist als bisher angenommen, wobei Proteine wie SEC31A potenziell verschiedene Transportwege auf eine Weise verbinden, die zuvor schwer zu detektieren war. Die Studie etabliert eine neue, minimal verzerrte Strategie für die räumliche Proteomik und öffnet die Tür zu einem tieferen Verständnis dynamischer biologischer Prozesse in lebenden Systemen mit größerer Klarheit und Tiefe.