Single Cell Cytometry of Mouse Brain Tissue

يُعد الدماغ شبكة كثيفة ومعقدة حيث تتشبث مليارات الخلايا ببعضها البعض، مغلفة بعزل دهني ومدعومة بشبكة معقدة من البروتينات الهيكلية. ولدراسة هذه الخلايا بشكل فردي، يجب على العلماء أولاً فصلها عن هذه المصفوفة اللزجة، وتحويل قطعة صلبة من الأنسجة إلى سائل يتدفق بحرية من الخلايا المفردة. وتُعرف هذه العملية، التي تسمى "التفكيك" (dissociation)، بأنها صعبة للغاية بالنسبة للدماغ لأن خلاياه مترابطة بإحكام وهشة للغاية؛ فإذا سُحبت بقوة زائدة، تموت الخلايا أو تفقد الميزات ذاتها التي يحتاج الباحثون لرؤيتها. لعقود من الزمن، كافح العلماء لإيجاد طريقة لتفكيك الأنسجة دون تدمير الخلايا الرقيقة بداخلها، وهو تحدٍ حدّ من قدرتنا على فهم كيفية عمل التجمعات المتنوعة من الخلايا العصبية والخلاية المناعية في الدماغ أثناء الصحة والمرض.

لقد رسم فريق من الباحثين في جامعة كولورادو أنشوتز الطبية مساراً موثوقاً لتجاوز هذه الصعوبة. فقد شرعوا في اختبار مجموعة متنوعة من الطرق لتحويل أنسجة دماغ الفأر البالغ إلى معلق من الخلايا المفردة، مقارنين بين التقطيع الميكانيكي البسيط وعدة تركيبات إنزيمية مختلفة. لم يكن هدفهم مجرد إخراج الخلايا، بل إخراجها حية وسليمة، مع الحفاظ على التنوع الكامل لسكان الدماغ. لقد اختبروا طرقاً استخدمت القوة الميكانيكية وحدها، وإنزيم "أكيوتيز" (Accutase) الأكثر قوة، وثلاث تركيبات إنزيمية أكثر لطفاً تتضمن "باباين" (papain) و"كولاجيناز" (collagenase) و"ديسباز" (dispase)، ممزوجة بإنزيم يقطع الحمض النووي المتشابك لمنع التكتل. كما اختبروا خطوة شائعة تُستخدم لتنظيف العينة: وهي تمرير السائل عبر هلام سميك لفصل الحطام الثقيل عن الخلايا.

وجد الباحثون أن التركيبات الإنزيمية اللطيفة كانت تعمل بكفاءة مماثلة للطرق الأكثر قسوة في إنتاج خلايا حية. وعندما عالجوا حوالي مائة ملليغرام من أنسجة الدماغ، استعادوا قرابة أربعمائة ألف خلية حية، وهو رقم كان ثابتاً سواء كانوا ينظرون إلى المادة البيضاء أو المادة الرمادية. ولم يغير نوع الإنزيم اللطيف المستخدم بشكل كبير العدد الإجمالي للخلايا التي يمكن حصادها. ومع ذلك، قدمت الدراسة تحذيراً واضحاً بشأن خطوة التنظيف؛ فعندما استخدم الباحثون الهلام السميك لإزالة الحطام، فقدوا ما يقرب من تسعين بالمائة من خلاياهم الحية. والخلايا القليلة التي نجت من هذه الغسلة لم تكن تمثيلاً عادلاً للنسيج الأصلي؛ إذ قامت العملية بإزالة أنواع معينة من الخلايا بشكل انتقائي، مثل الخلايا الداعمة التي تغلف الألياف العصبية، بينما تركت خلفها نسبة أعلى من الخلاط المناعية. وهذا يعني أنه بالنسبة للدراسات التي تتطلب صورة كاملة للمشهد الخلوي للدماغ، فإن خطوة التنظيف هذه كانت ذات نتيجة عكسية.

ولرؤية ما تحتويه عيناتهم بدقة، استخدم الفريق تقنية قوية تسمى "التنميط الخلوي الكتلي" (mass cytometry)، والتي تحدد الخلايا عبر وسمها بمعادن ثقيلة بدلاً من الضوء. وقد سمح لهم ذلك بعدّ وتوصيف سبعة أنواع رئيسية من الخلايا، بما في ذلك الخلايا العصبية، والخلايا النجمية، والخلايا الدبقية قليلة التغصن، والخلايا البطانية، والخلايا الهدبية، والخلايا الدبقية الصغيرة، والخلايا البيضاء. واكتشفوا أن الدماغ يحتوي على مزيج غني من هذه الخلايا، حيث كانت الخلايا العصبية هي الأكثر وفرة، تليها مجموعة كبيرة من الخلايا الداعمة والمناعية. والأهم من ذلك، وجدوا أنه يمكنهم تجميد هذه الخلايا، وتخزينها، وإذابتها لاحقاً دون فقدان التوازن العام لأنواع الخلايا. وبينما كانت بعض الخلايا الداعمة أقل شيوعاً قليلاً بعد التجميد، إلا أن النسب النسبية للمجموعات الرئيسية ظلت متطابقة تقريباً مع العينات الطازجة. وتعتبر هذه النتيجة مهمة لأنها تعني أن الباحثين يمكنهم جمع العينات في أوقات مختلفة وتحليلها معاً، بدلاً من الاضطرار لإجراء كل تجربة فور التضحية بالحيوان.

كما بحثت الدراسة في الحالة الداخلية للخلايا لمعرفة ما إذا كانت عملية التحضير قد سببت لها الإجهاد. فقد تحققوا من علامات انقسام الخلايا والإشارات الكيميائية المحددة التي تشير إلى استجابة الخلية للإجهاد. ولم يجدوا أي خلايا منقسمة، وهو أمر متوقع في دماغ البالغين السليم، وظلت معظم إشارات الإجهاد منخفضة. التغيير الوحيد الملحوظ كان زيادة طفيفة ومستمرة في إشارة إجهاد محددة داخل الخلايا الدبقية الصغيرة (microglia)، وهي الخلايا المناعية المقيمة في الدماغ، بعد تجميدها وإذابتها. ويشير هذا إلى أنه بينما تظل الخلايا قابلة للحياة وممثلة للواقع، فإن عملية التجميد تثير رد فعل طفيف في الخلايا المناعية تحديداً.

في نهاية المطاف، يوفر هذا العمل "وصفة معيارية" لتحضير أنسجة دماغ الفأر تحافظ على التنوع الحقيقي للعضو. ومن خلال إظهار أن الإنزيمات اللطيفة تعمل بشكل جيد دون الحاجة إلى خطوة إزالة الحطام التي تدمر معظم العينة، ومن خلال التأكيد على إمكانية تجميد الخلايا دون فقدان هويتها، أزال الباحثون عائقاً رئيسياً أمام دراسة الدماغ. يتيح نهجهم للعلماء فحص التفاعلات المعقدة بين الخلايا العصبية والخلايا المناعية بطريقة كانت صعبة سابقاً، مما يوفر رؤية أوضح لآليات عمل الدماغ الداخلية دون التشوه الناتج عن طرق التحضير القاسية.