Single Cell Cytometry of Mouse Brain Tissue

De hersenen zijn een dicht, ingewikkeld netwerk waar miljarden cellen aan elkaar kleven, omhuld door vetachtige isolatie en ondersteund door een complex web van structurele eiwitten. Om deze cellen individueel te bestuderen, moeten wetenschappers ze eerst scheiden van deze plakkerige matrix, waarbij een solide stuk weefsel wordt omgezet in een vrij stromende vloeistof van enkelvoudige cellen. Dit proces, bekend als dissociatie, is berucht moeilijk voor de hersenen omdat de cellen er zo nauw met elkaar verbonden en fragiel zijn; trek te hard en de cellen gaan dood of verliezen de zeer specifieke kenmerken die onderzoekers willen zien. Decennialang hebben wetenschappers geprobeerd een methode te vinden die het weefsel uit elkaar haalt zonder de delicate cellen binnenin te vernietigen, een uitdaging die onze mogelijkheid om te begrijpen hoe de diverse populatie van neuronen en immuuncellen in de hersenen functioneert in gezondheid en ziekte, heeft beperkt.

Een team onderzoekers aan de University of Colorado Anschutz Medical Campus heeft nu een betrouwbaar pad door deze moeilijkheid uitgestippeld. Ze zetten zich scharpe af om verschillende manieren te testen om volwassen muirhersenweefsel om te zetten in een suspensie van enkelvoudige cellen, waarbij ze mechanisch hakken tegenover verschillende verschillende enzymmengsels afzetten. Hun doel was niet alleen om cellen naar buiten te krijgen, maar om ze levend en intact naar buiten te krijgen, waarbij de volledige diversiteit van de bewoners van de hersenen behouden blijft. Ze testten methoden die alleen mechanische kracht gebruikten, een sterker enzym genaamd Accutase, en drie zachtere enzymcombinaties bestaande uit papaine, collagenase en dispase, gemengd met een enzym dat verstrengeld DNA afbreekt om klontering te voorkomen. Ze testten ook een veelvoorkomende stap die wordt gebruikt om het monster op te schonen: het laten centrifugeren van de vloeistof door een dikke gel om zwaar afval te scheiden van de cellen.

De onderzoekers ontdekten dat de milde enzymmengsels net zo goed werkten als de hardere methoden bij het produceren van levende cellen. Wanneer ze ongeveer honderd milligram hersenweefsel verwerkten, herstelden ze ongeveer vierhonderdduizend levende cellen, een aantal dat consistent was, of ze nu keken naar de witte stof of de grijze stof. Het specifieke type mild enzym dat werd gebruikt, veranderde de totale hoeveelheid cellen die ze konden oogsten niet significant. De studie leverde echter een duidelijke waarschuwing op over de reinigingsstap. Wanneer de onderzoekers de dikke gel gebruikten om afval te verwijderen, verloren ze bijna negentig procent van hun levende cellen. De weinige cellen die deze wasbeurt overleefden, waren geen eerlijke representatie van het oorspronkelijke weefsel; het proces had selectief bepaalde celtypen verwijderd, zoals de ondersteunende cellen die de zenuwvezels omwikkelen, terwijl een hoger aandeel immuuncellen achterbleef. Dit betekende dat voor studies die een volledig beeld vereisen van het cellulaire landschap van de hersenen, deze reinigingsstap contraproductief was.

Om precies te zien wat er in hun monsters zat, gebruikte het team een krachtige technologie genaamd massacytomie, die cellen identificeert door ze te labelen met zware metalen in plaats van licht. Dit stelde hen in staat om zeven belangrijke celtypen te tellen en te karakteriseren, waaronder neuronen, astrocyten, oligodendrocyten, endotheelcellen, ependymcellen, microglia en leukocyten. Ze ontdekten dat de hersenen een rijke mix van deze cellen bevatten, waarbij neuronen het meest talrijk waren, gevolgd door een grote populatie ondersteunende cellen en immuuncellen. Cruciaal was dat ze ontdekten dat ze deze cellen konden invriezen, opslaan en later ontdooien zonder de algemene balans van celtypen te verliezen. Hoewel een paar specifieke ondersteunende cellen iets minder voorkwamen na het invriezen, bleven de relatieve proporties van de belangrijkste groepen bijna identiek aan de verse monsters. Deze bevinding is significant omdat het betekent dat onderzoekers monsters op verschillende momenten kunnen verzamelen en samen kunnen analyseren, in plaats van gedwongen te zijn elke experiment direct na het offeren van het dier uit te voeren.

De studie keek ook naar de interne staat van de cellen om te zien of het voorbereidingsproces hen stress had bezorgd. Ze controleerden op tekenen van celdeling en specifieke chemische signalen die aangeven dat een cel reageert op stress. Ze vonden geen delende cellen, wat te verwachten is in een gezonde volwassen brein, en de meeste stresssignalen bleven laag. De enige opmerkelijke verandering was een kleine, consistente toename van een specifiek stresssignaal binnen de microglia, de residentiële immuuncellen van de hersenen, na het invriezen en ontdooien. Dit suggereert dat hoewel de cellen vitaal en representatief blijven, het vriesproces specifiek een milde reactie in de immuuncellen triggert.

Uiteindelijk biedt dit werk een gestandaardiseerd recept voor het voorbereiden van muirhersenweefsel dat de ware diversiteit van het orgaan behoudt. Door aan te tonen dat milde enzymen goed werken zonder de noodzaak van een stap voor het verwijderen van afval die het grootste deel van het monster vernietigt, en door te bevestigen dat cellen bevroren kunnen worden zonder hun identiteit te verliezen, hebben de onderzoekers een grote barrière weggenomen voor het bestuderen van de hersenen. Hun aanpak stelt wetenschappers in staat om de complexe interacties tussen neuronen en immuuncellen te onderzoeken op een manier die voorheen moeilijk was, wat een helderder beeld biedt van de innerlijke werking van de hersenen zonder de verstoring die wordt veroorzaakt door harde voorbereidingsmethoden.