Single Cell Cytometry of Mouse Brain Tissue

मस्तिष्क एक सघन, जटिल नेटवर्क है जहाँ अरबों कोशिकाएँ एक साथ जुड़ी रहती हैं, जो वसायुक्त इन्सुलेशन (fatty insulation) में लिपटी होती हैं और संरचनात्मक प्रोटीनों के एक जटिल जाल द्वारा समर्थित होती हैं। इन कोशिकाओं का व्यक्तिगत रूप से अध्ययन करने के लिए, वैज्ञानिकों को पहले उन्हें इस चिपचिपे मैट्रिक्स से अलग करना होगा, जिससे ऊतक के एक ठोस टुकड़े को एकल कोशिकाओं के मुक्त-प्रवाह वाले तरल में बदला जा सके। यह प्रक्रिया, जिसे पृथक्करण (dissociation) कहा जाता है, मस्तिष्क के लिए विशेष रूप से कठिन है क्योंकि इसकी कोशिकाएं बहुत कसकर जुड़ी और नाजुक होती हैं; यदि बहुत ज़ोर से खींचा गया, तो कोशिकाएं मर जाती हैं या वे ठीक वही विशेषताएं खो देती हैं जिन्हें शोधकर्ता देखना चाहते हैं। दशकों से, वैज्ञानिक एक ऐसी विधि खोजने के लिए संघर्ष कर रहे थे जो मस्तिष्क की कोशिकाओं को नष्ट किए बिना ऊतक को अलग कर सके, एक ऐसी चुनौती जिसने स्वास्थ्य और रोग में मस्तिष्क की विविध आबादी के कार्य को समझने की हमारी क्षमता को सीमित कर दिया था।

कोलोराडो Anschutz मेडिकल कैंपस के शोधकर्ताओं की एक टीम ने अब इस कठिनाई के माध्यम से एक विश्वसनीय मार्ग का मानचित्र तैयार किया है। उन्होंने वयस्क चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों को एकल-कोशिका निलंबन (single-cell suspension) में बदलने के विभिन्न तरीकों का परीक्षण करने के लिए कई तरीकों का उपयोग किया, जिसमें सरल यांत्रिक काटने (mechanical chopping) की तुलना कई अलग-अलग एंजाइम मिश्रणों से की गई। उनका लक्ष्य केवल कोशिकाओं को बाहर निकालना नहीं था, बल्कि उन्हें जीवित और सुरक्षित रूप से बाहर निकालना था, ताकि मस्तिष्क के निवासियों की पूर्ण विविधता को संरक्षित किया जा सके। उन्होंने उन विधियों का परीक्षण किया जिनमें केवल यांत्रिक बल का उपयोग किया गया था, एक मजबूत एंजाइम 'एक्यूटेस' (Accutase), और पेपैन (papain), कोलेजेनेज (collagenase) और डिस्पेस (dispase) से युक्त तीन सौम्य एंजाइम संयोजन, जिन्हें एक ऐसे एंजाइम के साथ मिलाया गया था जो गुच्छे बनने से रोकने के लिए उलझे हुए डीएनए (DNA) को काटता है। उन्होंने नमूने को साफ करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एक सामान्य चरण का भी परीक्षण किया: भारी मलबे को कोशिकाओं से अलग करने के लिए तरल को एक गाढ़े जेल के माध्यम से घुमाना।

शोधकर्ताओं ने पाया कि सौम्य एंजाइम मिश्रण जीवित कोशिकाओं को उत्पन्न करने के मामले में कठोर विधियों के समान ही प्रभावी थे। जब उन्होंने लगभग सौ मिलीग्राम मस्तिष्क ऊतक को संसाधित किया, तो उन्होंने लगभग चार लाख जीवित कोशिकाएं प्राप्त कीं, और यह संख्या श्वेत द्रव्य (white matter) या धूसर द्रव्य (gray matter) दोनों में समान थी। उपयोग किए गए विशिष्ट सौम्य एंजाइम के प्रकार ने कोशिकाओं की कुल संख्या को महत्वपूर्ण रूप से नहीं बदला। हालाँकि, अध्ययन ने सफाई के चरण के बारे में एक स्पष्ट चेतावनी दी। जब शोधकर्ताओं ने मलबे को हटाने के लिए गाढ़े जेल का उपयोग किया, तो उन्होंने अपनी लगभग नब्बे प्रतिशत जीवित कोशिकाओं को खो दिया। जो कुछ कोशिकाएं इस धुलाई में जीवित बचीं, वे मूल ऊतक का उचित प्रतिनिधित्व नहीं करती थीं; इस प्रक्रिया ने चुनिकी रूप से कुछ विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं को हटा दिया था, जैसे कि तंत्रिका तंतुओं को लपेटने वाली सहायक कोशिकाएं, जबकि प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अनुपात अधिक छोड़ दिया। इसका अर्थ था कि मस्तिष्क के पूर्ण परिदृश्य के अध्ययन के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं में, यह सफाई चरण प्रतिगामी था।

अपने नमूनों में वास्तव में क्या है, यह देखने के लिए टीम ने मास साइटोमेट्री (mass cytometry) नामक एक शक्तिशाली तकनीक का उपयोग किया, जो कोशिकाओं को प्रकाश के बजाय भारी धातुओं से टैग करके उनकी पहचान करती है। इसने उन्हें सात प्रमुख प्रकार की कोशिकाओं को गिनने और उनका लक्षण वर्णन करने की अनुमति दी, जिनमें न्यूरॉन्स, एस्ट्रोसाइट्स (astrocytes), ओलिगोडेंड्रोसाइट्स (oligodendrocytes), एंडोथेलियल कोशिकाएं (endothelial cells), एपेंडिमल कोशिकाएं (ependymal cells), माइक्रोग्लिया (microglia) और ल्यूकोसाइट्स (leukocytes) शामिल हैं। उन्होंने पाया कि मस्तिष्क में इन कोशिकाओं का एक समृद्ध मिश्रण मौजूद है, जिसमें न्यूरॉन्स सबसे प्रचुर मात्रा में हैं, उसके बाद सहायक कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी है। महत्वपूर्ण रूप से, उन्होंने पाया कि वे इन कोशिकाओं को जमा सकते (freeze), संग्रहीत कर सकते हैं और बाद में उन्हें पिघला (thaw) सकते हैं, बिना कोशिकाओं के प्रकारों के समग्र संतुलन को खोए। हालांकि जमने के बाद कुछ विशिष्ट सहायक कोशिकाएं थोड़ी कम आम थीं, लेकिन प्रमुख समूहों का सापेक्ष अनुपात ताजे नमूनों के लगभग समान बना रहा। यह खोज महत्वपूर्ण है क्योंकि इसका अर्थ है कि शोधकर्ता नमूनों को अलग-अलग समय पर एकत्र कर सकते हैं और उनका एक साथ विश्लेषण कर सकते हैं, बजाय इसके कि उन्हें हर प्रयोग को जानवर की मृत्यु के तुरंत बाद करना पड़े।

अध्ययन ने कोशिकाओं की आंतरिक स्थिति को भी देखा कि क्या तैयारी प्रक्रिया ने उन्हें तनावग्रस्त किया है। उन्होंने कोशिका विभाजन और विशिष्ट रासायनिक संकेतों की जांच की जो कोशिका के तनाव के प्रति प्रतिक्रिया करने का संकेत देते हैं। उन्होंने पाया कि कोई विभाजित कोशिका नहीं थी, जो एक स्वस्थ वयस्क मस्तिष्क में अपेक्षित है, और अधिकांश तनाव संकेत कम ही रहे। एकमात्र उल्लेखनीय परिवर्तन माइक्रोग्लिया (microglia), जो मस्तिष्क की निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाएं हैं, के भीतर एक विशिष्ट तनाव संकेत में मामूली और निरंतर वृद्धि थी, जो उन्हें जमाने और पिघलाने के बाद देखी गई। यह सुझाव देता है कि जबकि कोशिकाएं व्यवहार्य और प्रतिनिधि बनी रहती हैं, जमने की प्रक्रिया विशेष रूप से प्रतिरक्षा कोशिकाओं में एक हल्का सा रिएक्शन (reaction) शुरू करती है।

अंततः, यह कार्य चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों को तैयार करने के लिए एक मानकीकृत नुस्खा प्रदान करता है जो अंग की वास्तविक विविधता को संरक्षित करता है। यह दिखाते हुए कि सौम्य एंजाइम बिना उस मलबे-निकासी चरण के भी अच्छी तरह काम करते हैं जो अधिकांश नमूने को नष्ट कर देता है, और यह पुष्टि करते हुए कि कोशिकाओं को उनकी पहचान खोए बिना जमाया जा सकता है, शोधकर्ताओं ने मस्तिष्क के अध्ययन में एक बड़ी बाधा को दूर कर दिया है। उनका दृष्टिकोण वैज्ञानिकों को न्यूरॉन्स और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच जटिल अंतःक्रियाओं की जांच करने की अनुमति देता है जो पहले कठिन था, जिससे कठोर तैयारी विधियों के कारण होने वाले विरूपण के बिना मस्तिष्क की आंतरिक कार्यप्रणाली का स्पष्ट दृश्य प्राप्त होता है।