Single Cell Cytometry of Mouse Brain Tissue

Il cervello è una rete densa e intricata dove miliardi di cellule si aggregano tra loro, avvolte in un isolamento grasso e sostenute da una complessa trama di proteine strutturali. Per studiare queste cellule individualmente, gli scienziati devono prima separarle da questa matrice appiccicosa, trasformando un pezzo solido di tessuto in un liquido fluido di singole cellule. Questo processo, noto come dissociazione, è notoriamente difficile per il cervello perché le sue cellule sono così strettamente legate e fragili; se si tira troppo forte, le cellule muoiono o perdono proprio le caratteristiche che i ricercatori hanno bisogno di osservare. Per decenni, gli scienziati hanno lottato per trovare un metodo che scomponga il tessuto senza distruggere le delicate cellule all'interno, una sfida che ha limitato la nostra capacità di comprendere come la diversificata popolazione di neuroni e cellule immunitarie del cervello funzioni in salute e in malattia.

Un team di ricercatori della University of Colorado Anschutz Medical Campus ha ora tracciato una via affidabile attraverso questa difficoltà. Si sono posti l'obiettivo di testare una varietà di modi per trasformare il tessuto cerebrale di topo adulto in una sospensione a singola cellula, confrontando il semplice taglio meccanico con diverse miscele enzimatiche. Il loro obiettivo non era solo estrarre le cellule, ma estrarle vive e intatte, preservando la piena diversità degli abitanti del cervello. Hanno testato metodi che utilizzavano solo la forza meccanica, un enzima più forte chiamato Accutase e tre combinazioni enzimatiche più delicate che coinvolgevano papaina, collagenasi e dispasi, tutte mescolate con un enzima che frammenta il DNA aggrovigliato per prevenire l'appiccicosità. Hanno anche testato un passaggio comune utilizzato per pulire il campione: far ruotare il liquido attraverso un gel denso per separare i detriti pesanti dalle cellule.

I ricercatori hanno scoperto che le miscele enzimatiche delicate funzionavano altrettanto bene dei metodi più duri nel produrre cellule vive. Quando hanno elaborato circa cento milligrammi di tessuto cerebrale, hanno recuperato circa quattrocentomila cellule vive, un numero che era costante sia che guardassero la materia bianca o la materia grigia. Il tipo specifico di enzima delicato utilizzato non cambiava significativamente il numero totale di cellule che potevano raccogliere. Tuttavia, lo studio ha fornito un chiaro avvertimento riguardo al passaggio di pulizia. Quando i ricercatori hanno usato il gel denso per rimuovere i detriti, hanno perso quasi il novanta per cento delle loro cellule vive. Le poche cellule sopravvissute a questo lavaggio non erano una rappresentazione equa del tessuto originale; il processo aveva rimosso selettivamente certi tipi di cellule, come le cellule di supporto che avvolgono le fibre nervose, lasciando invece una proporzione maggiore di cellule immunitarie. Ciò significava che per gli studi che richiedevano un quadro completo del panorama cellulare del cervello, questo passaggio di pulizia era controproducente.

Per vedere esattamente cosa ci fosse nei loro campioni, il team ha utilizzato una tecnologia potente chiamata citometria di massa, che identifica le cellule marcandole con metalli pesanti invece che con la luce. Ciò ha permesso loro di contare e caratterizzare sette tipi principali di cellule, tra cui neuroni, astrociti, oligodendrociti, cellule endoteliali, cellule ependimali, microglia e leucociti. Hanno scoperto che il cervello conteneva un ricco mix di queste cellule, con i neuroni che erano i più abbondanti, seguiti da una grande popolazione di cellule di supporto e cellule immunitarie. Fondamentalmente, hanno scoperto che potevano congelare queste cellule, conservarle e scongelarle in seguito senza perdere l'equilibrio complessivo dei tipi cellulari. Sebbene alcune cellule di supporto specifiche fossero leggermente meno comuni dopo il congelamento, le proporzioni relative dei gruppi principali rimanevano quasi identiche ai campioni freschi. Questa scoperta è significativa perché significa che i ricercatori possono raccogliere campioni in tempi diversi e analizzarli insieme, invece di essere costretti a eseguire ogni esperimento immediatamente dopo il sacrificio dell'animale.

Lo studio ha anche esaminato lo stato interno delle cellule per vedere se il processo di preparazione le avesse stressate. Hanno controllato i segni di divisione cellulare e specifici segnali chimici che indicano che una cellula sta reagendo allo stress. Non hanno trovato cellule in divisione, il che è previsto in un cervello adulto sano, e la maggior parte dei segnali di stress rimaneva bassa. L'unica variazione degna di nota è stata un piccolo e costante aumento di un segnale di stress specifico all'interno della microglia, le cellule immunitarie residenti nel cervello, dopo il congelamento e lo scongelamento. Ciò suggerisce che, sebbene le cellule rimangano vitali e rappresentative, il processo di congelamento innesca una lieve reazione specificamente nelle cellule immunitarie.

In definitiva, questo lavoro fornisce una ricetta standardizzata per preparare il tessuto cerebrale di topo che preserva la vera diversità dell'organo. Dimostrando che gli enzimi delicati funzionano bene senza la necessità di un passaggio di rimozione dei detriti che distrugge la maggior parte del campione, e confermando che le cellule possono essere congelate senza perdere la loro identità, i ricercatori hanno rimosso una barriera importante nello studio del cervello. Il loro approccio permette agli scienziati di esaminare le complesse interazioni tra neuroni e cellule immunitarie in un modo che era precedentemente difficile, offrendo una visione più chiara del funzionamento interno del cervello senza la distorsione causata da metodi di preparazione duri.